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实验一
普通光学显微镜的使用
显微镜的构造,低倍镜、高倍镜和油镜的使用。
细菌制片的观察。
4学时
实验二
培养基的制备与灭菌
培养基的方法及高压蒸汽灭菌方法
实验三
细菌的革兰氏染色
无菌操作步骤及细菌革兰氏染色的方法
综合实训
发酵乳实验
掌握发酵乳生产的工艺流程
实验一普通光学显微镜的使用
一、目的要求
1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。
2、了解油镜的原理,并掌握其使用方法。
二、实验原理
(一)、普通光学显微镜的构造
普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈(虹采)、聚光镜(集光器)等(图1-1)。
(二)、油浸系的原理
浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油,调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜,一般都刻有放大倍数,如95x、100x等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示,国外产品则用“Oil”(OilImmersion)或HI(homogeneousImmersion)表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长,镜片最小,这也是识别的另一种标志。
其使用原理是:
由于香柏油与玻璃的折光率相似(香柏油为1.515,玻璃为1.52)。
镜检时,滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中,避免光线通过折光率低的空气(折光率为1.0)而散失,因而能提高物镜的分辨率,使物像明亮清晰(见图1-2)。
三、实验器材
1、菌种金黄色葡萄球菌及大肠杆菌。
2、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
四、方法步骤
(一)显微镜油镜的使用
1、用低倍镜对光。
2、低倍镜观察(寻找观察目标)。
3、高倍镜观察(选取理想的观察目标)。
4、油镜观察:
高倍镜观察后----上升镜微--油镜转至正下方在载玻片上加一小滴香柏油--小心地下降镜微使镜头浸在油里----用粗螺旋将镜微缓慢上升,寻找目标(物象)----用螺旋调节,使物象清晰----观察记录。
5、观察完毕。
上升镜筒转动物镜转换器,使油镜物镜偏位。
用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹,最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。
6、将显微镜各部分还原,放回箱中。
(二)细菌三态的观察
按照上述步骤用油镜观察标本后绘图。
五、结果与思考
1、绘图记录观察结果。
2、思考题
用油镜观察时应注意哪些问题?
在载玻片和镜头之间加滴什么油?
起什么作用?
实验二培养基的制备与灭菌
掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
掌握培养基的配置方法。
掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性.因而用于培养微生物的培养基的种类也很多,它们的配方及配制方法虽各有差异。
但一般培养基的配制程序却大致相同.例如器皿的准备,培养基的配制与分装,棉塞的制作,培养基的灭菌,斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
三、实验材料
药品:
待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
仪器及玻璃器皿:
天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
其他物品:
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤
(一)玻璃器皿的洗涤和包装
1.玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中.用毛刷刷洗,然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡,再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2.灭菌前玻璃器皿的包装
培养皿的包扎:
培养皿由一盖一底组成一套,可用报纸将几套培养皿包成一包,或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内,加盖灭菌。
包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
移液管的包扎:
在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉),它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内,并防止菌液等吸入口中。
塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右,棉花自身长度约1~1.5cm。
塞棉花时.可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。
棉花要塞得松紧适宜,吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条,然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端,约成45℃角,折叠纸条包住尖端,用左手握住移液管身,有手将移液管压紧.在桌面上向前搓转,以螺旋式包扎起来。
上端剩余纸条,折叠打结,准备灭菌。
(二)液体及固体培养基的配制过程
1.液体培养基配制
称量:
一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品,先按培养基配方计算出各成分的用量.然后进行准确称量。
溶解:
将称好的药品置于一烧杯中,先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水),用玻璃棒搅动,加热溶解。
定容:
待全部药品溶解后,倒入一量筒中,加水至所需体积。
如某种药品用量太少时,可预先配成较浓溶液,然后按比例吸取一定体积溶液,加入至培养基中。
调pH:
一般用pH试纸测定培养基的pH。
用剪刀剪出一小段pH试纸,然后用镊子夹取此段pH试纸,在培养基中蘸一下,观看其pH范围,如培养基偏酸或偏碱时,可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液进行调节。
调节pH时,应逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部过酸或过碱,破坏培养基中成分。
边加边搅拌,并不时用pH试纸测试,直至达到所需pH为止。
过滤:
用滤纸或多层纱布过滤培养基。
一般无特殊要求时,此步可省去。
2.固体培养基的配制
配制固体培养基时,应将已配好的液体培养基加热煮沸,再将称好的琼脂(1.5~2%)加入,并用玻棒不断搅拌,以免糊底烧焦。
继续加热至琼脂全部融化,最后补足因蒸发而失去水分。
(三)培养基的分装
根据不同需要,可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内,分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口,造成污染。
如操作不小心,培养基沾污管口或瓶口时,可用镊子夹一小块脱脂棉,擦去管口或瓶口的培养基,并将脱脂棉弃去。
1.试管的分装
图8-2培养基的分装
取一个玻璃漏斗,装在铁架上,漏斗下连一根橡皮管,橡皮管下端再与另一玻璃管相接,橡皮管的中部加一弹簧夹。
分装时,用左手拿住空试管中部,并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内,以右手拇指及食指开放弹簧夹,中指及无名指夹佐玻璃管嘴,使培养基直接流入试管内。
装入试管培养基的量视试管大小及需要而定,若所用试管大小为15×
150mm时,液体培养基可分装至试管高度1/4左有为宜;
如分装固体或半固体培养基时,在琼脂完全融化后,应趁热分装于试管中。
用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5(约3—4mI),半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。
2.三角瓶的分装
用于振荡培养微生物时,可在250m1三角瓶中加入50m1的液体培养基;
若用于制作平板培养基用时,可在250m1三角瓶中加入150ml培养基,然后再加入3g琼脂粉(按2%计算),灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
(四)棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎
为了培养好气性微生物,需提供优良通气条件,同时为防止杂菌污染,则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。
通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。
1.试管棉塞的制作
制棉塞时,应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块,铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上,用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞.然后直接压入试管或三角瓶口。
也可借用玻璃棒塞入,也可用折叠卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞应紧贴管壁,不留缝隙,以防外界微生物沿缝隙侵入,棉塞不宜过紧或过松,塞好后以手提棉塞,试管不下落为准。
棉塞的2/3在试管内,1/3在试管外。
目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。
将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆,外面包上一层牛皮纸。
用记号笔注明培养基名称及配制日期,灭菌待用。
2.三角瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布,再塞在瓶口上。
有时为了进行液体振荡培养加大通气量,则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上,目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。
在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上,再包上一层牛皮纸并用线绳捆好,灭菌待用。
(五)培养基的灭菌
培养基经分装包扎后,应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。
(六)斜面和平板的制作
1.斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管,趁热置于木棒或玻棒上,使成适当斜度,凝固后即成斜面。
斜面长度不超过试管长度l/2为宜。
如制作半团体或固体深层培养基时,灭菌后则应垂直放置至凝固。
2.平板的制作
将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后,待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。
温度过高时,皿盖上的冷凝水太多;
温度低于50℃,培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行,左手拿培养皿,右手拿三角瓶的底部或试管,左手同时用小指和手掌将棉塞打开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开一缝,至瓶口正好伸入,倾入10~15mL培养基,迅速盖好皿盖,置于桌上,轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿中,冷凝后即成平板。
(七)培养基的灭菌检查
灭菌后的培养基,一般需进行无菌检查。
最好取出1~2管(瓶),置于37℃温箱中培养1~2天,确定无菌后方可使用。
(八)无菌水的制备
在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。
在每支试管内装4.5mL蒸馏水,塞上棉塞或硅胶塞。
再在棉塞上包上一张牛皮纸,高压蒸汽灭菌。
0.1MPa灭菌20~30min。
五、实验内容
根据要求清洗各种玻璃器皿,并进行包扎。
根据要求配制各种培养基。
用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。
用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。
六、实验报告
简述移液管和培养皿的包扎注意事项。
简述配制培养基的基本步骤及注意事项。
为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花,再用报纸包起来,经高压蒸汽灭菌后才能使用?
为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞(硅胶塞)才能使用?
配制培养基时为什么要调节pH?
高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短?
实验三革兰氏染色法
1、学习并初步掌握革兰氏染色法。
2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是:
1、初染:
结晶紫染色
2、媒染:
碘液媒染
3、脱色:
乙醇脱色
4、复染:
番红复染
经此法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌(G+);
细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色(红色)的细菌为革兰氏阴性菌(G-)。
细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
初染后,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物,增强染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时,革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇脱色时细胞壁脱水,使肽聚糖层的网状结构孔经缩小,透性降低,从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。
三、器材:
1、菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。
2、染色剂革兰氏染色液。
3、仪器及其他用具载玻片,显微镜等。
四、操作步骤:
1、涂片:
将大肠杆菌(24h)和金黄色葡萄球菌(24h)分别涂片、干燥、固定。
2、染色:
(1)初染:
加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗
(2)媒染:
滴加碘液冲去残水,并覆盖一分钟,水洗
(3)脱色:
将水甩净,并衬以白背景,用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止,约20—30秒,立即用水冲净乙醇
(4)复染:
用番红液染1--2分钟,水洗
3、镜检:
干燥后,油镜观察。
以分散开的细菌颜色为准,革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
4、混合制片观察:
一载玻片上两种菌混合制片,对比观察。
五、实验报告:
1、结果:
列表简述2株细菌的染色观察结果(形状、颜色、革兰氏染色反应)。
2、思考题:
1)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?
其染色成败的关键步骤是什么?
2)当你对一株未知菌进行革兰氏染色时,怎样能确证你的染色技术操作正确,结果可靠?
实验六酸奶的制作
酸奶是将牛奶经高温灭菌后接入乳酸菌发酵制成的一种发酵型乳制品。
酸奶不仅营养丰富、容易消化和吸收,而且含有乳酸和大量乳酸菌,在肠道能抑制有害微生物生长,增强人体免疫机能,预防乳腺癌,有利消化,促进食欲,并克服了乳糖不耐症,是补钙的理想食品。
一、实验目的
1、了解酸奶的制作原理和凝固型酸奶的制作工艺流程。
2、掌握普通凝固型酸奶制作的操作要点。
二、材料及用具
1、原料:
牛乳;
白砂糖;
发酵剂,本实验用市售原味凝固性酸乳,每小组准备2-3瓶。
2、主要仪器设备与用具
三角瓶(每人1-2瓶),封口膜,量筒,不锈钢勺,温度计,玻棒,灭菌锅,培养箱,冰箱,净化工作台,天平,pH试纸等。
三、实验步骤
1、工艺流程
蔗糖
↓
鲜乳→净化→配料→均质→杀菌→冷却(37—45℃)→接种→发酵→冷藏后熟→成品↑
发酵剂
2、操作要点
(1)原料乳选择:
选用鲜牛奶或者奶粉。
原料乳的质量要求:
生产酸乳的原料乳,要求酸度在18º
T以下,细菌总数不高于50万CFUmL-1,总干物质含量不得低于11.5%,其中非脂乳固体不低于8.5%。
原料乳不得使用病畜乳和残留抗菌素、杀菌剂、防腐剂的牛乳。
(2)配料:
在消毒过的容器(三角瓶)中放入鲜牛奶,加入6~7g/100mL白砂糖(本实验采用6.5%的加糖量),不断搅拌。
(3)均质:
原料配合后进行均质处理。
均质处理可使原料充分混匀,有利于提高酸乳的稳定性和稠度,并使酸乳质地细腻,口感良好。
均质所采用的压力以20-25MPa为好。
(4)杀菌:
采用90~95℃,杀菌5分钟,对原料乳进行杀菌。
(5)冷却:
将杀菌后的乳冷却至46~48℃后,准备接种。
(6)接种:
接种量可根据菌种活力、发酵方法等的不同而定。
本实验接种方法与接种量:
用洁净的灭菌勺,去掉市售原味酸乳表层的1—2cm后,按市售酸奶:
原料乳为1:
10的比例,接入已灭过菌且冷却至46~48℃的热牛奶中,充分搅拌混匀。
(7)发酵:
发酵剂混匀后,迅速置于41~42℃恒温箱中培养,这是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌最适生长温度的折中值。
发酵时间一般在3—4h。
达到凝固状态时,即可终止发酵。
发酵终点一般可依据如下条件来判断:
①滴定酸度达到60-70º
T以上;
②pH值低于4.6;
③表面有少量水痕;
④倾斜酸奶瓶或杯,奶变粘稠。
发酵过程中应注意:
避免震动,否则会影响组织状态;
发酵温度应恒定,避免忽高忽低;
发酵室内温度上下均匀;
掌握好发酵时间,防止酸度不够或过度以及乳清析出。
(8)冷藏后熟:
发酵结束后,应立即移入0~5℃的冰箱中,终止发酵过程,使酸乳的特征(质地、口昧、酸度等)达到所设定的要求。
另外,冷藏还具有促进香味物质产生,改善酸乳硬度的作用。
一般将酸乳终止发酵后第12-24h小时称为后熟期,在此期间香味物质的产生会达到高峰期。
0~5℃贮藏24h,即可出售。
3、酸奶的质量标准
(1)酸奶感官指标:
①色泽:
色泽均匀一致,呈乳白色或稍带微黄色。
②滋味和气味:
具有酸甜适中、可口的滋味和酸奶特有风味,无酒精发酵味、霉味和其它不良气味。
③组织状态:
凝块均匀细腻,无气泡,允许有少量乳清析出。
(2)酸奶理化指标:
①非脂乳固体含量≥8.5%
②脂肪含量≥3.2%
③蛋白质含量≥3.2%
④总糖(以蔗糖计)含量≥8.0%
⑤酸度(以pH计)发酵后4.5-5.0冷藏后3.5-4.0
四、思考题
1、酸奶制作原理?
2、酸奶的营养与保健作用主要有哪些?
1、体内净肠:
调理肠胃内细菌平衡,净化肠胃、刺激肠胃蠕动。
减少便秘的发生且能消除口臭,防止腹胀,腹痛。
2、体外美容:
酸奶具有极佳的嫩肤功能。
3、常喝酸奶防衰老:
修补遗传物质,使病变细胞恢复正常,加强抗氧化剂的活性,防止细胞老化。
4、食用无糖酸奶有助于糖尿病的预防和治疗。
5、酸奶中的嗜酸乳杆菌及双岐菌可产生抗癌物质或减少癌症的发生。
6、常喝酸奶可降低血液中胆固醇含量,减少心血管疾病发生的危害
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