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Keywords:
Tobacco;
Starch;
Determination
前言
淀粉(nativestarch)是白色、无臭、无味的粉状物质,它由许多个D-葡萄糖糖苷键结合而成的多糖,可以用通式(C6H10O5)n表示[1]。
淀粉一般由直链淀粉(amylose,Am),和支链淀粉(amylopection,Ap),两大主要成分组成,直链淀粉和支链淀粉的分子结构、相对分子质量和理化特性等有很大差异。
它们在淀粉酶的作用下水解为分子量较小的糊精和麦芽糖,糊精和麦芽糖进一步分解转化形成葡萄糖和果糖,其转化途径是:
水解产物麦芽糖是α-D-葡萄糖的苷。
所以淀粉的构成单元是α-葡萄糖[2]。
直链淀粉分子约由1000个以上D-吡喃葡萄糖通过α-1,4苷键相连而成,相对分子质量为1.5×
105~6.0×
105。
直链淀粉通过分子内氢键的相互作用,使分子链卷曲成螺旋形的构象存在,每一圈螺旋有6个葡萄糖单元,螺旋形构象又在分子链上各极性基因的相互作用下再发生弯曲与折叠[3]。
张革新等[4]用分子力学以及分子动力学方法得到的直链淀粉优化模型是一条螺旋长链,证明文献报道的螺旋形结构与实际相符合。
支链淀粉由线型直链淀粉短链组成,且具有高度分支结构,约20个葡萄糖单元一个分支,分支处由α-l,6-糖苷键连接形成树枝状。
支链淀粉分子比直链淀粉分子大很多,其相对分子质量约在1.0×
105~1.0×
106之间,分子中有多个非还原性末端,但只有一个还原性末端。
直链淀粉与支链淀粉的部分结构如图1、图2所示。
图1直链淀粉的结构(α-1,4苷键)的一部分
图2支链淀粉结构(α-1,4苷键和α-1,6苷键)的一部分
直链淀粉与支链淀粉结构的区别,决定了他们性质的不同,其性质的比较如下表1:
表1直链淀粉与支链淀粉的性质比较
直链淀粉的性质
支链淀粉的性质
能溶于热水
在加热、加压下才溶于水
水溶液不很黏稠
水溶液极黏稠
溶液易聚沉,并结成半固体的凝胶体
溶液不易聚沉,不形成凝胶体
遇碘变蓝色
遇碘变成红紫色
有光泽
无光泽
能被β淀粉酶完全分解
只能被β淀粉酶分解一部分黍
乙酰衍生物薄膜坚韧而有弹性
乙酰衍生物薄膜发脆、无弹性
淀粉是植物体中贮存的养分,多存在种子和块茎中,大米中含淀粉62%~86%,麦子中含淀粉57%~75%,玉米中含淀粉65%~72%,马铃薯中则含淀粉超过90%。
烟草的鲜烟叶中淀粉含量通常为20%~30%,有的高达为40%左右;
在经过调制烘烤后,其淀粉含量能降低到1%~6%[5]。
淀粉在烟叶片细胞中的合成、积累、分解、转化状况,决定着烤后叶片内部各种化学成分之间的协调程度。
因此,烤烟叶片在大田生育期间积累一定的淀粉是必要的。
烟叶经调制、发酵后,淀粉大多转化为小分子碳水化合物,这些小分子碳水化合物参与调节烟气酸碱平衡,对烟气醇和性与芳香性具有重要作用[1,6]。
宫长荣[7]、王怀珠等[8]人通过在湿度、温度上的控制以及外加酶的方法来促进淀粉在调制中的转化。
烤后烟叶中淀粉含量是决定烟叶内在品质和外观品质的重要因素,WeekwW等[9]研究表明,初烤后烟叶残留的淀粉是对烟叶色、香、味不利的化合物,一方面淀粉会影响燃烧速度和燃烧的完全性,另一方面淀粉在燃吸时会产生糊焦气味,对烟气产生不良影响[10-11]。
美国优质烤烟的淀粉含量则为1.0%~2.0%,津巴布韦强调烤烟淀粉含量必须在3.0%以下[12],我国烤烟淀粉含量大约为4%~6%[13]。
精确测定烟草中淀粉在不同时期,不同环节中的含量,将对深入研究淀粉精细结构提供帮助,将有利于解析烤烟品质和风格的形成机理,全面揭示调制过程烟草吸食品质形成的生化基础。
这些研究对于揭示烟草香吃味形成的机理,具有十分重要的理论和实践意义。
本文将介绍应用于食品行业淀粉测定中的国标法、比色法、双波长法和多波长法、碘亲和力测定法、近红外法、排阻色谱分析法、差示扫描量热法、伴刀豆球蛋白法八种方法和烟草行业中淀粉的检测方法,旨在探索提高烟草淀粉检测的精度。
1食品中淀粉的检测方法
近年来,随着现代分析技术的发展,国内外食品淀粉的检测着重于在对直链淀粉的检测上。
对直链淀粉含量的准确测定方法进行了大量的研究,并取得了极大的进展。
现就对几种主要的方法进行简单的介绍和评述:
1.1国标法
1.1.1酸水解法
原理:
样品用乙醚除去脂肪及可溶性糖类后,其中淀粉用酸水解成具有还原性的单糖,然后按还原糖测定,折算成淀粉。
用酸水解法不易去除还原糖,同时酸易使高分子碳水化合物(如半纤维素)的水解,造成较大的干扰,使结果往往偏高[14]。
1.2.2酶水解法
样品用乙醚除去脂肪及可溶性糖类后,其中淀粉用淀粉酶水解成双糖,再用盐酸将双糖水解成单糖,最后按还原糖测定,并折算成淀粉。
酶水解法不易去除还原糖,同时酶的种类多,且作用专一难以使淀粉完全水解[15]。
1.2比色法
1.2.1碘显色光度法
直链淀粉与碘生成纯蓝色,其检测的最大吸收波长为620nm,支链淀粉与碘生成紫红色,其检测的最大吸收波长为540nm。
碘比色法原理:
根据碘与直链淀粉与支链淀粉作用呈现不同程度的蓝紫色,用比色法可测出样品中两种组分的含量,同时也可以将其一起检测出作为总淀粉的值。
张峻松等[16]通过对烟草中淀粉的检测,结果表明,方法的回收率为96.8%,CV=0.97%,方法的重复性较好。
但该方法中,因为支链淀粉与碘形成的络合物,在直链淀粉-碘络合物最大吸收波长处也会吸收波长,从而导致测得的直链淀粉含量偏高,使得总淀粉的检测不准确。
1.2.2蒽酮比色法
用乙醇溶液去除样品中的可溶性糖,再用高氯酸溶解残留物中的淀粉,达到对淀粉的提取,在浓硫酸的作用下,蒽酮与淀粉反应生成蓝绿色的化合物,用分光光度计在640nm下测定吸光度。
郭冬生等[15]通过用蒽酮比色法和酶水解法的比较,结果表明高氯酸水解-蒽酮比色法与酶水解法有很强的相关性,两者相关系数R2=0.9959(p<0.01),但其具有测定结果误差较小,操作步骤快捷简便的优点。
但此方法中,因为高氯酸是具有强氧化性的强酸,可破坏纤维素和木质素等碳水化合物成分,产生葡萄糖类似物,造成最终检测结果较大的误差。
1.3双波长法和多波长法
由于比色法运用的单波长检测,存在直、支链淀粉-碘复合物的吸收峰的重叠及其他背景的吸收的干扰,其结果的准确性依赖于直、支链淀粉含量和比例、链长组成及其分布[17],和只能测定直链淀粉含量的局限,因此,以增加检测波长加以改进,有了双波长、多波长的方法。
双波长比色法原理:
如果溶液中某溶质在两个波长处均有吸收,则两个波长的吸光度差值与溶质浓度成正比。
用与待测样品相应的标准品配制的直链淀粉和支链淀粉的标准溶液分别与碘反应,然后在同一个坐标系里进行扫描(400~960nm)或作吸收曲线,作图确定直链淀粉的测定波长和参比波长λ2、λ1,支链淀粉的测定波长和参比波长λ4、λ3。
再将待测样品与碘显色,在选定的波长处作4次比色,然后利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。
因测定的是试样在两波长处的吸光度差值,扣除了两类淀粉吸收背景的相互影响,故可提高测定的灵敏度和选择性。
戴双等[18]、范明顺等[19]、Jarvis和Walker[20]、Sé
ne等[21]都对单波长法、双波长、多波长法进行了实验,得出随着波长的增多,检测的精度也在不断的提高,但测量也随之变得复杂,计算也变得繁琐,应用不多。
1.4碘亲和力测定法(包括安培滴定法和电位滴定法)
碘亲和力滴定法原理:
当淀粉溶液用碘进行电位滴定时,在碘与淀粉形成络合物期间没有电学性质(电流、电压)变化,但一旦有游离碘存在,立即产生电位(或电流),就可看到电位(或电流)的变化,而后可从电位(或电流)滴定曲线求出形成络合物的碘量,计算相当于碘结合量的淀粉量。
具体测定方法有:
电位滴定法和电流滴定法,这两种方法都要先用纯直链淀粉和支链淀粉,绘制出电位(或电流)滴定曲线,然后用样品滴定,最后根据滴定数值求出样品中直链淀粉和支链淀粉的含量。
因为碘亲和力会随着淀粉的来源不同而不同,每一种淀粉都有其特定的碘亲和力值,其值的大小主要取决于淀粉中直链淀粉的含量,直链淀粉含量越高,碘亲和力值也越大,所以常用碘亲和力来确定淀粉中直链淀粉的含量[23]及作为评定直链淀粉纯度的一项指标[24]。
曹忙[25]、陈俊芳等[26]对电位滴定法进行了实验,结果表明该方法与比色法相比,更加科学合理、精确可靠,而且其直线回归方程相关系数更加接近,测得的结果更稳定、重复性更高,且方法简便、快速、准确,适合对大批量样品(如育种、品种普查等)的测定。
然而此方法,由于支链淀粉也可以与碘形成络合物,因此在测定中会降低游离碘的浓度,导致直链淀粉检测的误差;
且此方法不适合于测定不同植物来源的淀粉样品。
1.5近红外法
近红外光谱分析法(NIRS)是近年来发展起来的一种新的定量分析技术,具有快速、简便、准确的特点,不消耗化学试剂,不污染环境,不破坏样品,可以一次扫描进行多项检测等优点。
近红外法原理是利用有机化合物在近红外区具有特征吸收,从而对样品中的有机化学成分进行快速定量分析。
Fertig等[27]、彭建等[28]对近红外法进行了实验,结果表明,对于比较简单的混合样品的所得直链淀粉含量与供应商所提供的数据有较好的相关性,结果是准确可靠的,且其快速、微量、无损性检测很适合大批量育种分析,具有常规化学分析方法无可比拟的优越性。
然而此方法有其局限性:
首先近红外仪器价格昂贵,不利于广泛推广,其次,近红外光谱分析结果的准确性与定标模型建立的质量和模型的合理使用有很大关系,要使其准确就需要扩大检测范围,这需要收集尽可能多的样品,这需要消耗很大的人力物力,且近红外模型难以对淀粉含量做精确的测定,对于特殊的材料(直链淀粉含量很低或很高的材料)也不能做出精准的评价,不适合作为样品和所测项目经常变化的分散性样品检测的手段[29]。
1.6排阻色谱分析法
排阻色谱法(SEC)[30]又称尺寸排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
其原理比较特殊,类似于分子筛,待分离组分在进入凝胶色谱后,会依据分子质量的不同,分为能进入和不能进入固定相凝胶的孔隙中,不能进入的如支链淀粉分子会很快随流动相洗脱,而能够进入的如直链淀粉以及介于直链和支链间的多糖分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相,从而实现了根据分子质量的差异对各组分的分离[31]。
天然淀粉中直链淀粉的相对分子质量最小,一般在几万到几百万之间,支链淀粉的相对分子质量最大,约在几百万到几亿之间,存在两者间的中间级分是介于直链淀粉和支链淀粉之间的多糖成分[32]。
将淀粉样品通过凝胶排阻色谱,得到的排阻色谱图可能具有1~3个峰,代表直链淀粉、中间级分和支链淀粉,根据分子排阻色谱图可计算出淀粉样品中直链淀粉的含量。
Gerard等[33]、Grant等[34]、Charoenkul等[35]对SEC法进行了实验,结果表明,该方法测定直链淀粉百分含量不仅准确,节省时间,而且安全性高,因为上述方法采用去蒸馏水作为流动相,而不需要其他腐蚀性或致癌性溶液来溶解淀粉和作为流动相,使得操作更为简单和环保。
1.7差示扫描量热法(DSC)
差示扫描量热法(DSC)是原理:
根据[36]溶血磷脂酰胆碱(LPC)极性端基团与淀粉的螺旋形结构可相互作用产生络合物,并且该络合物所形成的放热曲线与淀粉中直链淀粉含量成比例关系。
Mestres等人[37]和Polaske等人[38]对DSC进行试验,结果表明,差示扫描量热法步骤比较简单操作步骤简单,而且目前许多DSC设备都配置有自动取样装置,可进行自动分析。
1.8伴刀豆球蛋白法
伴刀豆球蛋白法的原理是根据伴刀豆球蛋白(ConA)能够与多个非还原性末端基团上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基单位特异性结合,由于多分支的支链淀粉链中有大量非还原性端基的α-D-葡萄糖残基,因此ConA可在指定的pH值、温度和离子强度下,与淀粉中的支链淀粉成分特定的结合并生成沉淀,但是不能结合以线性为主的直链淀粉成分[39]。
Yun和Matheson[40]首先提出了采用ConA测定直链淀粉含量的方法,但其过程比较复杂,Gibson等[41]人对测定过程进行了简化。
经实验证明,伴刀豆球蛋白法没有水解过度的、络合物的吸收重叠等影响因素,就不存在不确定性问题,测定结果准确性高,可适应于不同植物来源的淀粉样品,不需要使用直链淀粉、支链淀粉校准曲线,同时还可测出总淀粉含量。
因此,它是目前最为精准有效的检测方法。
2、烟草行业中淀粉的检测方法
烟草中淀粉的检测方法是在借鉴食品中的检测方法而建立的,现将目前烟草中使用的方法介绍如表2:
表2烟草中淀粉的检测方法
标准
原理
淀粉标准品
样品处理步骤
样品前处理时间
YC/T216-2007烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法[42]
在酸性的条件下与碘发生反应
直链淀粉和支链淀粉纯品(马铃薯来源)
1、去色,2、高氯酸提取淀粉,3、在570nm波长下检测。
40min
YCT283-2009烟草及烟草制品淀粉的测定酶水解-离子色谱法[43]
利用酶将淀粉水解成葡萄糖,通过离子交换分离-电化学检测定量测定葡萄糖,最终换算为淀粉的含量。
葡萄糖;
1、提取淀粉,2、酶水解成葡萄糖3、检测葡萄糖
5.5h
费林试剂直接滴定法[44]
淀粉酸水解成具有还原性质的单糖,将费林试剂中的二价铜还原为一价铜,以亚甲基蓝为指示剂,滴定终点为无色,计算还原糖的含量,最终换算成淀粉含量。
葡萄糖
1、去除可溶性糖,2、酸水解成单糖,3、滴定
3h
酶水解-DNS比色法[45]
用酶将淀粉水解为葡萄糖,加DNS试剂,在520nm波长下测定葡萄糖,最终换算为淀粉含量。
1、去除可溶性糖,2、酶水解成单糖,3、检测葡萄糖。
1.25h
高效液相色谱法测定烟草中的淀粉含量[46]
酸水解为葡萄糖后,用高效液相色谱检测葡萄糖,最终换算为淀粉的含量。
1、去除可溶性糖,2、算水解成单糖,3、过色谱柱分离,检测葡萄糖。
3.5h
通过表2,可知:
(1)、烟草中的方法虽然采用了很多先进的仪器,但其原理主要还是利用的酸水解、酶水解转化为葡萄糖和直接碘显色法;
(2)、检测中使用的淀粉标品来源均不是烟草中的淀粉,其直链与支链淀粉的比值也只能是大概的参照值;
(3)、从检测时间和操作步骤看,采用碘显色连续流动法所需时间是最短的,操作最简单的,但在570nm下检测测定时,它存在烟草自身颜色的干扰。
通过本研究小组实验发现,采用《YC/T216-2007烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》,以显色剂与水混合作为参比,选取淀粉含量在30%的样品和淀粉含量为10%的样品比较,加入碘显色剂后,在570nm下检测其吸光度值样品与空白的比值,含量30%的比值为190倍,含量10%的比值为9倍的现象(该结果尚未发表)。
从这可以看出,检测烟叶样品含量低的样品,烟叶自身颜色对检测结果的干扰还是很大的。
(4)、采用酶水解淀粉,酶有很好的专一性,减免了其他物质水解的干扰,但由于其专一性,也使得直链与支链的水解不够彻底,从而使得检测结果不准确。
3结语
通过对行业内外淀粉方法的对比,可以看出:
(1)、酸水解法、酶水解法、光波长法、电化学法存在单糖干扰或者淀粉中直链与支链间相互干扰等影响因素,不能使淀粉中的直链与支链分开;
(2)、排阻色谱分析法、差示扫描量热法和伴刀豆球蛋白法去除了单糖干扰,能将直链淀粉与支链淀粉分离开检测;
但是除伴刀豆球蛋白法,以上方法都需要与样品一致的标品,而目前烟草行业还没有烟草自身的淀粉标准,这就影响了检测的精度。
而伴刀豆球蛋白法则是适用不同植物来源的淀粉样品,它采用的是葡萄糖作为标准。
因此,可以借用伴刀豆球蛋白法作为烟草淀粉检测精确测定的方法。
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