人CD14转基因细胞系的成立Word文档下载推荐.docx

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【关键词】转基因细胞系

　　EstablishmentofMurineCellLineTransfectedwithHumanCD14Gene

　　AbstractThisstudywasaimedtoconstructtheCD14eukaryoticexpressionvector，establishthetransgeneicCD14positivecelllineinordertofacilitatetheestablishmentofamousemodelofantibodytargetingtherapyforhumanacutemonocyticleukemia（AML-M5）.TotalRNAextractedfromperipheralbloodmononuclearcellswastreatedwithRNAase-freeDNAase，thehumanCD14genewasclonedandsequencedthroughtheRT-PCRandT-Acloneexpressionalvector（+）/CD14wasconstructedbycleavingwithdoublerestrictionendonuleasesandligatingwithT4murinemelanomacelllineB16wastransfectedwiththe（+）/CD14recombinantwithSuperfecttransfectioncloneswereselectedbyG418andtheexpressionofhumanCD14onthetransfectantwasconfirmedbyflowcytometry（FCM）.TheresultsindicatedthatthesequenceofthehumanCD14cDNAclonedwasexacttobesameastheonefromGenBankrecombinant（+）/CD14wasidentifiedwithdouble-enzymeexpressionofthehumanCD14onthetransfectant（B16/CD14）wasconfirmedbyconclusion，themurinecelllineB16/CD14fransfectedwithhumanCD14genehasbeenestablishedwhichcanbeusedforthestudyofhumanAML-M5antibodytargetingtherapywithmousemodel.

　　KeywordsCD14；

transgeneiccellline；

acutemonocyticleukemia;

mousemodel

急性单核细胞白血病（AML-M5）是难治性白血病之一，CD14是M5细胞膜上的特异性标志，它在其它细胞成份包括T、B、自然杀伤细胞（NK）、红细胞、血小板、造血干/祖细胞和非造血系统细胞上不表达［1］，而且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，因此CD14是导向医治AML-M5的良好靶点。

本研究组已经将自制鼠源性抗人CD14单克隆抗体（ZCH-7-2F9）研制成基因工程抗体，拟进一步进行动物实验。

为了成立良好的动物模型，一个稳固表达人CD14抗原分子的肿瘤细胞系是重要的环节。

但是，除病人新鲜M5细胞外，国际上很少有CD14表达的单核细胞系存在，从而对该研究的深切进行带来困难。

目前，大多数研究室仍然通过VitD3诱导单核细胞来源的细胞株U937来取得CD14阳性表达的细胞系［3］，这不仅不能保证CD14表达的均一性，也无益于人M5白血病动物模型的成立及其体内导向医治的研究，通过转基因技术成立表达人CD14抗原的鼠肿瘤细胞系是解决这一问题的可行途径。

为此，咱们利用C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16的高效转染性，初步成立人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为CD14阳性白血病动物模型的成立奠定了基础。

　　材料和方式

　　标本、主要试剂及仪器

　　单核细胞来自正常人外周血，入口直标单克隆抗体CD14-PE、γ1-FITC、γ1-PE为美国BectonDickinson公司产品；

2F9-FITC为本实验室研制的直标鼠抗人CD14单克隆抗体试剂；

TrizoL液、高保真度TaqDNA聚合酶、LowDNAMolecularMassLadder标准分子量购自Invitrogen公司；

M-MLV逆转录酶、RNasin○R核糖核苷酸酶抑制剂、RQ1无RNA酶的DNA酶、pGEM○R-TEasyVector系统、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）购自Promega公司；

QIAquickDNA纯化试剂盒购于Qiagen公司；

RPMI1640培育基、EcoRI、HindⅢ和XbaⅠ内切酶及G418购于GibcoBRL公司；

全自动测序仪（ABIPRISM377）为P-E公司仪器；

FACSCabliburTM流式细胞仪购自美国BectonDickinson公司；

哺乳动物表达载体pcDNA（+）购自Invitrogen公司。

　　细胞株及受体菌

　C57BL/6黑色素瘤细胞B16冻存于浙江大学附属邵逸夫医院中心实验室；

大肠

　　杆菌DH5α由曹江博士惠赠。

　　引物

　　按照NCBIGenBank检索的人CD14cDNA序列设计上下游引物，别离含有HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，委托上海生物技术工程有限公司合成：

上游引物为：

5′A↓AGCTTATGGAGCGCGCGTCCTGCTTGTTGCTG3′（HindⅢ），下游引物为：

5′T↓CTAGATTAGGCAAAGCCCCGGGCCCCTTGGAGC3′（XbaⅠ）。

　　重组质粒（＋）/CD14的构建

　　取正常人的外周血2ml，以等体积的磷酸盐缓冲液（phospholatebuffersolution，PBS）稀释，加入2ml的淋巴细胞分离液，3000×

g离心20分钟，分离取得单个核细胞，以1ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，取得CD14基因片段。

PCR反映条件为：

94℃5分钟，94℃30秒，57℃30秒，72℃50秒，共30个循环，72℃延伸7分钟。

％琼脂糖电泳显示扩增出目的基因片段，取PCR产物2μl克隆到pGEM○R-TEasyVector中，命名为pGEM○R-TEasy/CD14，EcoRI酶切结果阳性的克隆纯化后委托上海博亚公司采用ABIPRISM377进行测序分析，测序结果与GeneBank中检索的结果对比核实。

HindⅢ和XbaⅠ双酶切纯化的pGEM○R-TEasy/CD14和（+），％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquickGel，切胶回收目的片段和空载体，按摩尔比3∶1进行连接，连接产物转化DH5α感受态，挑取单菌落扩大培育后抽提质粒，HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定，将重组质粒（＋）/CD14纯化后转染B16细胞。

所涉及的酶切、连接、重组子的挑选及大量制备等实验方式均参考《分子克隆实验指南》［4］进行。

　　细胞培育

　　小鼠黑色素瘤细胞B16用含10％小牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI1640培育液，在5％CO2浓度、饱和湿度及37℃培育条件下培育。

　　重组质粒转染B16细胞及G418抗性克隆的挑选

　　用RPMI1640培育液（含小牛血清与双抗）将细胞悬液配成1×

105/ml浓度，以2ml/well于6孔板，24小时后，将纯化的质粒pcDNA（+）和pcDNA（+）/CD14，用Superfecttransfectionreagent并按其操作说明转染B16细胞。

24小时后换液，加G418进行挑选，每孔浓度为800μg/ml。

转染第12天，对6孔板上存活的细胞继续培育，G418浓度为800μg/ml，待明显的克隆长出来后，将单个克隆挑到24孔板扩大培育，G418浓度为800μg/ml。

　　CD14强阳性细胞系B16/CD14的初步挑选

　　用消化液将24孔板的细胞消化后，PBS洗涤2次，依照1×

105细胞/管加入流式细胞仪专用管，并加入μl标准CD14-PE和2F9-FITC，阴性对照及未转染的B16细胞组别离加入γ1-PE、CD14-PE、γ1-FITC和2F9FITC，4℃反映30分钟，PBS充分洗涤，用FACSCabliburTM流式细胞仪和CellQuest软件获取并分析10000个细胞。

结果

　　CD14cDNA的扩增

　　RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示扩增到1128bp大小的目的基因片段（图1），EcoRI酶切白色菌落抽提的质粒，10个克隆有9个克隆中有约1200bp的目的片段（图2）。

将其中1个EcoRI酶切阳性的质粒pGEM○R-TEasy/CD14纯化测序。

结果表明，扩增到的CD14基因与GenBank中的人CD14cDNA序列完全一致。

　　重组质粒（＋）/CD14的鉴定

　　（＋）/CD14经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见1128bp的CD14基因片段（图3）。

Figureanalysisof（+）/CD14withHindⅢandXbaⅠ.

　　转染后B16细胞的G418挑选

　　B16细胞转染（＋）/CD14和（＋）后，经G418加压挑选，未转染的B16细胞在含G418的RPMI1640培育液中，第10天全数离壁死亡，第12天转染组细胞绝大部份死亡，但可见散在生长的G418抗性细胞克隆。

　　CD14阳性B16/CD14细胞的挑选

　　应用标准的鼠抗人CD14直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC，通过流式细胞术检测到2株CD14部份阳性表达的B16/CD14细胞系，CD14阳性细胞百分数和平均荧光强度（MFI）别离见图4。

　　讨论

　　M5是急性髓系白血病（AML）中的常见类型，可分为未分化型（M5a）和部份化型（M5b）两种类型，它们恶性程度高，对化疗反映较差，长期预后不良。

大量研究表明，M5细胞表面具有大量内毒素脂多糖（LPS）受体CD14分子表达，且该分子特异性好、敏感性高，用抗人CD14单克隆抗体能识别结合该抗原分子，它是诊断M5的重要标志［5，6］。

CD14不仅是LPS和LPS/LBP复合物的受体，更是髓系单核/巨噬细胞分化的特异性表面标志抗原，主要在正常单核细胞和巨噬细胞上表达和在单核细胞相关性白血病细胞上大量表达，在其它细胞系统上不表达，在正常粒细胞上仅微弱表达或不表达［1］，且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，这为CD14作为靶向医治M5等单核细胞相关性疾病提供了有利条件。

为了成立人M5白血病的动物模型以便能更好地进行M5白血病的体外及体内导向医治研究，咱们通过脂质体转染法，利用B16细胞的高效转染性，成立了两株人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14。

人类编码CD14的基因已经被克隆和测序。

该基因位于，其基因组DNA约含1338个核苷酸残基。

从第76位核苷酸到第1200位，编码一段375个氨基酸残基的多肽链［7］，它由2个外显子编码，其中第1个外显子只含1个起始密码子ATG，紧接着是1个含88个核苷酸残基的内含子［8］。

为了避免基因组DNA的污染，咱们对单核细胞抽提的总RNA采用无RNA酶的DNA酶进行消化，保证了PCR模板是来自CD14的cDNA，而不是其基因组DNA。

另外，由于CD14基因的编码区超过1kb，为了确保PCR进程中Taq酶的忠实性，咱们采用高保真Taq酶。

测序结果和互联网数据核实情形表明，咱们所扩增的1128bp的人CD14基因序列是完全正确的。

B16细胞是来源于小鼠黑色素瘤的细胞株，本身不表达CD14分子，且其对等多种质粒具有高效转染性［9］。

G418对哺乳动物细胞具有高度的毒性，在400μg/ml的浓度下大部份的真核细胞即不能存活。

只有转染了含G418抗性基因的重组质粒并表达的B16细胞才能够存活生长。

咱们对有G418抗性的24个克隆进行扩大培育，每一个克隆搜集1×

105细胞，采用国际标准直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC［10］，通过流式细胞术检测发觉2个克隆的部份转染细胞表达CD14，CD14-PE检测的阳性细胞百分数别离为％和％，2F9-FITC检测结果别离为%和%％，而未转染和转染（＋）的B16细胞两种单克隆抗体检测结果均为阴性。

这些结果说明人CD14抗原在B16细胞膜上成功地取得表达，可是由于挑选贴壁细胞集落时不能做到1个集落来自于1个细胞，或集落培育的进程中部份G418抗性的细胞发生目的基因的丢失，使这两个集落有些G418抗性细胞不表达或低表达CD14分子。

本研究中，咱们成立了2株人CD14阳性表达的细胞系B16/CD14，并拟用G418选择培育基亚克隆后取得均一的、高纯度的、人CD14强阳性的细胞株。

人CD14抗原阳性表达的鼠细胞株B16/CD14的成立必将为人M5白血病动物模型的成立及其导向医治研究奠定坚实的基础。

【参考文献】

　　1MasonTypingVII.NewYork:

OxfordUniversityPress：

761-763

　　2PoussinC，FotiM，CarpentierJL，etendoto-xininternalizationviaamacropinocyticBiolChem，1998;

273:

20285-20291

　　3BotlingJ，ObergF，TormaH，etal.VitaminD3-andretinoicacid-inducedmonocyticdifferentiation:

interactionsbetweentheendogenousvitaminD3receptor，retinoicacidreceptors，andretinoidXreceptorsinU-937Growth；

7:

1239-1249

　　4萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T（金冬雁，黎孟枫译）.分子克隆实验指南.第2版.北京:

科学出版社，1992:

16-26

　　5LegrandO，PerrotJY，BaudardM，etal.Theimmunophenotypeof177adultswithacutemyeloidleukemia:

proposalofaprognostic，2000;

96:

870-877

　　6宁铂涛，汤永民，沈红强等.多参数流式细胞术检测急性白血病患者CD14表达的意义.临床儿科杂志，2003；

21:

197-199

　　7BaldiniM，LohmanIC，HalonenM，etal.APolymorphisminthe5′flankingregionoftheCD14geneisassociatedwithcircula-tingsolubleCD14levelsandwithtotalserumimmunoglobulinJRespirCellMolBiol，1999；

20：

976-983

　　8SuGL，DorkoK，StromSC，etal.CD14expressionandproductionbyhumanHepatol，1999；

31：

435-442

　　9赵可佳，程浩，陈民利等.表达人乳头瘤病毒6b和11型E6／E7基因的小鼠肿瘤细胞株的成立.中华皮肤科杂志，2004；

37:

91-93

　　10宁铂涛，汤永民，沈红强等.直标鼠抗人CD14单克隆抗体2F9-FITC的研制及鉴定.浙大学学报·

医学版，2005；

34:

167-171