基于雷帕霉素与FRB结合的蛋白质间相互作用的相关技术Word文档格式.docx
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RAP还有三烯臂结构域(C16-C23和C23-C31),可在RAP-FKBP12二元复合物基础上与mTOR的FRB域结合,抑制mTOR活性,发挥抗肿瘤等作用[2]。
基于RAP介导FKBP12与FRB间相互作用的研究基础上,近年来双分子荧光互补技术[3,4]、共振能量转移技术[5]等检测蛋白质间相互作用的新技术得到了长足的发展。
1FRB域结构与功能
FRB结构域位于mTOR氨基端2015-2114氨基酸残基之间,大小为11kD[6]。
X单晶衍射结构显示FRB由4个α螺旋通过短环联结形成四螺旋簇样三级结构,α1、α4-螺旋的交叉点附近6个氨基酸(Trp2101、Tyr2104、Tyr2105、Phe2108、Tyr2038和Phe2039)的芳香基团构成了浅表的疏水性结合区。
该域若缺失或突变如Ser2035→Ile/Thr或Tyr2105→Ala或Trp2027→Phe,均可阻止RAP-FKBP12-FRB三元复合物形成,导致mTOR激酶活性降低,产生RAP耐受。
体外研究表明,FRB域为mTOR激酶活性调节及细胞周期抑制作用的必需位点[7]。
Edwords等[8]研究表明,mTOR的FRB结构域具有内在的不稳定性及配体依赖性,当与配体稳定结合后表达增强,抑制mTOR活性作用。
2RAP结合FRB的技术
随着FRB结构的确证,RAP介导FKBP12与FRB蛋白间相互作用已成共识。
基于此作用方式研究小分子介导蛋白质相互作用的相关技术引起了众多学者的关注。
2.1RAP与FRB域直接结合的技术
多数研究表明,RAP结合mTOR的FRB域须先与胞内FKBP12结合,但亦有研究发现在缺乏FKBP12的情况下,RAP也可以结合FRB域,但亲和力很低[2]。
FKBP12-RAP-FRB三元复合物结构的X-衍射研究显示,FKBP12和FRB之间可与RAP结合的空间位置很小[9,10],故RAP直接结合FRB的亲和力较低。
Shor等[11]通过生化检测方法也发现,RAP及其同系物CCI-779抑制mTOR活性是否依赖FKBP12,与给药剂量有关。
Leone等[12]利用核磁共振波谱法发现了可直接与FRB结构结合的一类小分子配体,与RAP竞争相同的结合位点,但并非均有抑制mTOR活性的作用。
经核磁共振与AIRs-BDP(ambiguousinteractionrestraints-baseddockingprotocol)联用技术发现,抑制mTOR活性的小分子化合物与FRB结合的位点同磷脂酸(mTOR特异性激动剂)或RAP结合FRB的位点高度匹配[13,14]。
2.2研究FKBP12-RAP-FRB三元复合物形成的技术
蛋白质相互作用(protein-proteininteractions,PPIs)受细胞外环境刺激及胞内多条信号通路的影响,小分子化合物可综合胞内外环境变化从而介导蛋白质相互作用。
研究小分子化合物介导的蛋白质相互作用对于了解细胞中信号转导及确认药物作用靶标具有十分重要的意义[15]。
应用RAP介导FKBP12与FRB蛋白质相互作用的相关研究技术,为验证与检测其他多种蛋白质相互作用的新技术提供了可靠的操作平台。
2.2.1活细胞PPIs检测技术活细胞的PPIs检测方法主要有荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)和蛋白碎片互补分析(proteincomplementationanalysis,PCAs)。
Chen等[16]构建融合荧光蛋白,利用福斯特共振能量转移(FRET)方法在Hela细胞中检测RAP介导FKBP12与FRB相互作用的平衡解离常数(Kd),从而验证了FRET技术在研究活细胞中蛋白质间相互作用的亲和力是有效的。
Rosenfeldt等[17]应用生物发光共振能量转移(bioluminescenceresonanceenergytransferstrategy,BRET)分析技术,研究了融合C端介导信号隐花色素裂解的FKBP12和融合N端感光域的FRB蛋白间发生的结合作用,结果显示该技术在研究植物调节二聚化作用系统中亦具有效性。
有学者进一步改良了BRET技术,研究FKBP12-RAP-FRB三元复合物的形成在单个活细胞和在体动物中的分子成像,促进了高通量高敏感BRET分析技术的发展[18]。
此外,Galarneau等[19]利用TEM-1β-内酰胺酶的PCAs,在哺乳动物细胞中采用体外色度法与体内荧光分析结合的方法,定量分析了RAP介导FKBP12与FRB的相互作用。
另有学者基于正电子成像技术(PET)裂解报告分子(单纯疱疹病毒1型胸苷激酶)的Thr265与Ala266氨基酸,应用PCAs定量分析哺乳动物细胞中蛋白质相互作用以及在活体动物身上进行微PET成像分析,并且引入点突变(V119C)后,可显著增强PCAs分析时胸苷激酶的互补性。
这一技术在研究RAP介导FRB与FKBP12等多种蛋白质相互作用中得到了应用[20]。
然而FRET也存在一些缺陷,主要是检测敏感性和动态范围有限。
PCAs的主要不足是存在假阳性和假阴性。
Ferná
ndez-Suá
rez等[21]建立了一种全新的方法检测细胞内PPIs,应用酶-底物耦合,目的蛋白融合E.coli酶生物素连接酶(BirA),另一蛋白融合BirA的受体肽(AP)底物,如果两个蛋白有相互作用,BirA将催化AP的位点特异性生物素化作用。
利用BirA-AP耦合的专一性,构建融合蛋白FKBP-AP和FRB-BirA,经过体外纯化并通过抗生蛋白链菌素(streptavidin)染色,RAP可使FKBP-AP的生物素化增加5倍。
鉴于可利用此种方法在活细胞上进行标记,且生理作用未受干扰,因此该方法可用于检测瞬时发生的蛋白间相互作用。
2.2.2研究蛋白质动能的技术小分子控制蛋白质的二聚化系统已被广泛用于蛋白质动能的研究。
Kapitein等[22]为检测活细胞内部动力蛋白的活性运动,利用FKBP-RAP-FRB三元复合物系统研发了一种体外过氧化氢酶体运输分析技术,提供外源性和内源性驱动蛋白,肌动蛋白和肌球蛋白运动可诱导募集反应来驱动特异性的物质运输,从而检测出胞内动力蛋白的活性。
滴定和洗脱试验进一步显示由RAP介导的二聚化作用引起肌动蛋白募集反应具有剂量依赖性和不可逆性。
Xu等[23]提出在酵母菌中有条件地控制目标蛋白核转运的方案。
在此技术中,FKBP12融合了一个可作为核定位信号(nuclearlocalizationsignal)或出核转运序列(nuclearexportsequence)的蛋白,FRB则融合了荧光蛋白,RAP介导这两种融合蛋白的异二聚化。
由于这种相互作用是有选择地发生于核定位信号或出核转运序列控制下的目标蛋白,因此目标蛋白可在核中直接进出。
此种化合物介导的二聚化作用中,蛋白质的错位分布是可逆的,与其他系统相比该技术需要永久变异的目标蛋白,并且药物作用15min内允许蛋白质错位分布。
另有学者研究报道了特定蛋白快速可逆调节的方法。
内源性糖原合酶-3β(GSK-3β)基因融合FRB后导致GSK-3β的稳定性降低,产生一系列等位功能缺失,RAP促使GSK-3β-FRB结合FKBP12蛋白从而快速稳定GSK-3β-FRB,恢复蛋白活性;
当存在竞争性结合FKBP12的分子时,复合物的稳定性又可被快速逆转[24,25]。
有学者设计了一种新的配体调节肽(LiRP)系统,细胞渗透性小分子可调控LiRP与细胞内活性肽的结合。
当配体缺乏时,FKBP-肽-FRB-GST与LiRP融合在一起表达,可与目标蛋白自由结合;
当配体RAP或其同系物存在时,支架蛋白的构象变化将阻止肽类和目标蛋白间的相互作用。
LiRP系统可用于短时调节细胞及组织中蛋白质功能的研究[26,27]。
2.2.3其他技术胞内核磁共振谱分析筛选小分子间相互作用文库(SMILI-NMR),用于研究化合物干扰或增强两种或多种生物分子复合物间相互作用的能力。
有学者筛选出一个小的二肽文库,能取消FKBP-FRB蛋白复合物参与的细胞周期停滞,并在二肽的鉴定中表明了SMILI-NMR方法的实用性及有效性[28]。
Cre重组酶虽然广泛应用于试验动物的基因组调控,但缺乏有效的时序控制可使Cre重组酶活性降低。
有学者利用FKBP12-RAP-FRB异二聚化作用系统对Cre重组酶的调节进行了研究,Cre重组酶裂解后分别融合于FKBP12和FRB,RAP引起异二聚化作用可使Cre活性恢复。
体内外分析也表明,配体诱导的异二聚化作用是一种有效调节Cre活性的方式[29]。
基于photonic晶体(PC)传感器高通量分析鉴定蛋白质间相互作用,可通过一种D-biotin-tris-NTA(BTN)多聚化合物使His6-标签蛋白固定在PC传感器的表面,观察波峰值的改变检测蛋白质与其相应配体的结合。
Heeres等[30]利用此种技术将His6标记的FKBP12固定于PC传感器表面,发现由GST标记的FRB蛋白仅在RAP存在时与FKBP12结合,表明RAP介导这两蛋白间的相互作用。
3结语
综上所述,FRB域为RAP发挥药理作用的结合位点,从研究RAP结合FRB域有关的实验技术中,逐步发展了一系列可检测其他蛋白质相互作用的实用技术,经典的FKBP12-RAP-FRB三元复合物的形成为这些实用技术提供可靠的保证。
新技术的不断发展不仅为研究药物与FRB域的结合方式及研究mTOR抑制剂新药的确切机制提供了新的方法,而且为认识其他小分子介导的蛋白质相互作用提供了重要的技术手段。
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