克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的技术报告Word文档下载推荐.docx
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105~2×
105个),经10天左右抽取腹水,离心去除油脂和沉淀后,即为小鼠腹水单抗。
单抗效价测定将腹水或细胞上清倍比稀释后,按间接ELISA操作流程进行测定。
主要操作如下:
用包被缓冲液将包被用抗原S1–OVA稀释至适当的工作浓度,每微孔加100μL,4℃过夜,弃去孔内的液体。
每孔加封闭液200μL,37℃水浴保持2小时后用洗涤缓冲液洗3次,将腹水或细胞上清倍比稀释后按顺序加入,每孔100μL,每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。
37℃水浴1小时,每孔加适当浓度的酶标二抗100uL,置37℃水浴1小时。
每孔加新鲜配置的TMB底物液100μL,37℃水浴10~30分钟。
每孔加终止液50μL。
以待测孔光密度值(OD值)大于或等于阴性对照孔的2.1倍判为阳性。
以判为阳性的最高稀释倍数为效价判定终点效价。
重复3次,计算平均值。
交叉反应试验 将S1和其结构类似物沙丁胺醇、特普他林偶联载体RSA、OVA倍比稀释,每个浓度分别取50μL与50μL工作浓度的腹水在37℃水浴反应1小时,再加入到包被封闭好的酶标板微孔内反应1小时。
然后按间接ELISA操作流程加单抗及HRP-羊抗鼠IgG,测定OD450值,并计算交叉反应率,即Y=S/Z倍100%,其中S表示克伦特罗与50%抗体结合时的浓度,Z表示类似物与50%抗体结合时的浓度。
对克伦特罗的检测灵敏度测定:
方法同交叉反应试验,将不同浓度(0ppb-10ppb)的克伦特罗作为标准品代替类似物进行试验,最后450nm测定OD值,并计算抑制率(N-P)/N值(N为零标准品OD值,P为其它标准品OD值)。
用抑制率作纵坐标,标准品浓度的对数值作横坐标绘制标准曲线。
测定10个零标准管,求出光密度值的平均数X,再减去2倍标准差,从标准曲线上查出对应于光密度值为X-2SD的浓度,即为灵敏度。
3胶体金标记抗体蛋白
胶体金标记蛋白实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。
吸附机理可能是胶体金颗粒表面带负电荷,与蛋白质分子的正电荷之间靠静电力相互吸引,达到范德华引力范围内即形成牢固的结合。
胶体金颗粒的粗糙表面也是利于形成吸附的重要条件。
由于结合过程主要是物理吸附作用,并不影响蛋白质的生物活性。
由于盐类成分能影响金颗粒对蛋白质的吸附,并可使金颗粒聚沉,故标记前应先用低离子浓度的水透析,以除去多余的盐。
胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。
3.1抗体蛋白的处理
将待标记的抗体蛋白溶液用0.003moL/L的NaCL(pH9.0)4℃透析过夜,除去多余的盐离子,10000g4℃离心1h,除去聚合物。
3.2胶体金溶液的准备
用0.1moL/LK2CO3或0.1moL/LHCL调节胶体金溶液的pH值为7.0。
由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用pH计测定金溶液的pH值,一般使用精密pH试纸。
3.3稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择
3.3.1分光光度计测定法
将经过高速离心处理后的抗体用2mmoL/L磷酸盐缓冲液(pH10.3)稀释至0.3mg/mL。
稀释后抗体和其他试剂按表1逐项操作。
表1最适蛋白用量分光光度计测定法步骤
试剂
试验管
对照管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
抗体(µ
g)
15
20
25
30
35
40
45
50
H2O100µ
L
胶体金(mL)
1.0
摇匀,静置5min
10%NaCL(µ
L)
100
摇匀,静置5min后,测定520nm处OD值
以OD值为纵坐标,抗体蛋白用量为横坐标做一曲线,取曲线与横坐标相平行的区域始点所对应的抗体蛋白用量即为稳定胶体金的最小蛋白用量。
在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。
结果见图2。
图2最适蛋白用量分光光度计测定法
由图可知,当每1mL胶体金溶液中单抗添加量等于或大于16µ
g/mL时,胶体金蛋白结合物的光密度值不再发生较大的变化,趋于平稳,说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和,稳定胶体金的最小蛋白用量为每1mL金溶液中添加16µ
g抗体蛋白,在此基础上再增加10~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量。
最终确定实际蛋白用量为每1mL胶体金溶液中添加19.2µ
g抗体蛋白。
3.3.2目测法
具体步骤:
(1)0.1moL/LK2CO3或0.1moL/LHCL调节胶体金溶液pH为7.0。
(2)将pH7.0的胶体金溶液分装10管,每管1mL。
(3)待标记的抗体蛋白溶液用0.003moL/L,pH10.3磷酸盐缓冲液作系列稀释为15~45µ
g/mL,分别取1mL加入对应管的胶体金溶液中。
对照管加1mL稀释液(不含抗体蛋白),混匀。
(4)静置10min后,在上述各管中加入0.1mL10%NaCL溶液,混匀后静置2h,观察结果。
结果见表2。
表2目测法确定稳定胶体金最适蛋白用量
管号
蛋白添加量(µ
终颜色
蓝
浅蓝
红
由表可知,未加抗体蛋白(对照管)和加入抗体蛋白的量不足以稳定胶体金的1~2管,呈现由红变蓝的聚沉现象;
而加入抗体蛋白量达到或超过稳定胶体金的最小蛋白用量的3~10管保持红色不变。
其中含抗体蛋白量最低的3号试管即含稳定1mL胶体金所需的最小蛋白用量。
在此基础上再增加10~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量,即稳定胶体金的实际蛋白用量为每1mL胶体金溶液中添加19.2µ
3.3胶体金标记抗体蛋白具体步骤
3.3.10.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH7.0。
3.3.2将10ml胶体金溶液中加入50ml烧杯中,电磁搅拌器250rpm搅拌,逐滴加入1ml含0.19mg抗体蛋白的蛋白溶液。
3.3.3逐滴加入3ml5%RSA,持续搅拌10min。
3.4金标抗体的纯化(超速离心法步骤)
3.4.1金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。
红色上清溶液4℃,11000rpm离心40min。
3.4.2溶液分为三层,透明上清,管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。
将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中,用含1%RSA的0.01mol/LPB混悬至原量。
3.4.3平衡过夜,同上重复离心2次。
3.4.4最后用1%BSA的0.01mol/LPB(含0.02%NaN3)将沉淀混悬为原体积的1/40,4℃保存。
3.5金标抗体的质量鉴定
将羊抗兔二抗点样于NC膜上,直接与金标S1单抗作用,可见有明显的粉红色斑点,表明金标抗体有活性。
4包被抗原的合成与筛选
用于胶体金免疫层析试验的抗原和抗体必须有足够的敏感行、特异性和反应结合位点,能够和膜材料结合并与待测样品发生特异性反应。
本实验中共合成了3种包被抗原,在ELISA反应中都能和单抗发生特异性反应,但将3种抗原包被到NC膜上后,只有包被抗原B能与胶体金标记的单抗发生良好的显色反应。
这可能涉及到不同方法合成的包被抗原和NC膜的结合能力不同,同金标抗体的特异性结合反应也有差异,最后导致显色结果的不同。
用不同方法共合成了三种包被抗原:
包被抗原A,包被抗原B和包被抗原C。
4.1包被抗原A的合成
4.1.1取盐酸克伦特罗40mg用0.1M/L的HCL1.5ml溶解完全。
4.1.2滴加1%NaNO2(过量),4℃持续搅拌。
NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1%淀粉和50mmol/LKI进行监控。
游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘。
碘再与淀粉反应变成兰黑色。
4.1.3溶液变成蓝黑色后,继续反应15分钟。
4.1.4取OVA100mg用5mlpH9.0浓度为200mmol/L的硼酸缓冲液溶解。
4.1.5边搅拌边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量),调节pH至9.5
4.1.6冰箱中搅拌反应2小时,不断调节pH至9.0。
4.1.7用PBS透析2天。
得包被原1。
4.2包被抗原B的合成
4.2.1用0.5ml0.1mmol/LpH6.8的PBS稀释GA至浓度0.15mmol/L
4.2.210mg盐酸克伦特罗溶于0.5mlGA溶液中,
4.2.3取OVA80mg用4.5ml双蒸水溶解。
4.2.4将溶液
(2)逐滴加入到溶液(3)中。
室温下搅拌反应24小时。
4.2.5用0.02M的PBS透析三天,每8小时换一次液。
得包被原2。
4.3包被抗原C的合成
4.3.1取EDC100mg,用pH8.0的10mmol/LPBS液1.5mL使之充分溶解(Ⅰ液)。
4.3.2取盐酸克伦特罗40mg,用2ml双蒸水溶解(Ⅱ液)。
4.3.3取OVA100mg,溶于3ml10mmol/LPBS(PH8.0)液中(Ⅲ液)。
4.3.4将Ⅱ液与Ⅲ液混合,在磁力搅拌下逐滴加入Ⅰ液(余下0.5ml)。
4.3.5室温下避光搅拌1小时,逐滴加入余下的Ⅰ液。
4.3.64度搅拌12小时。
4.3.7静置10小时(4度)。
4.3.8用蒸馏水使之充分透析(约48小时),得包被原3。
4.3抗原的筛选
将三种包被抗原分别稀释到0.5mg/mL,再分别作1:
25、1:
50、1:
100、1:
150、1:
200、1:
250、1:
300稀释,在NC膜上点样,37℃温箱中干燥后,直接浸泡于金标抗体溶液中,观察不同抗原点样点的显色情况。
包被抗原C的点样显色非常浅,肉眼几乎无法分辨,包被抗原A最高稀释倍数为1:
100,而包被抗原B的最高稀释倍数可达到1:
250,故选择包被抗原B用于试纸条的组装。
5抗原包被各种溶液的筛选
5.1抗原包被液和包被条件的选择
分别用A、B、C、D、E五种不同配方的包被液将包被抗原作1:
100,1:
150,1:
200,1:
250,1:
300稀释,在NC膜上点样后37℃10min烘干,用封闭液封闭后,滴加2倍稀释的纯化后金标抗体,反应8min后,洗涤液洗涤,观察显色情况。
5.1.1包被液和包被条件的选择
判断标准:
+++表示着色很深,与背景反差很大;
++表示着色较深或着色很深但背景色也较深;
+表示着色淡或着色较深但有背景色;
—表示没有着色,或与背景色没有反差。
包被液筛选结果见表3。
表3包被液筛选结果
包被液
A
B
C
D
E
1:
+++
++
150
+
200
-
250
300
由表可知,包被液D在1:
250稀释后,NC膜上点样着色照样很深,而其他包被液在1:
250稀释后,颜色很淡或不显色,故选择包被液D作为实际用包被稀释液。
用包被液D将包被抗原作1:
300稀释,在NC膜上点样后分别37℃10min烘干和室温(20~25℃)30min自然干燥,其他条件不变,观察显色情况。
包被条件筛选结果见表4。
表4包被条件筛选结果
包被液D
37℃10min
室温(20~25℃)30min
由表可知,点样后,包被液在37℃10min烘干和室温(20~25℃)30min自然干燥的不同包被条件差异不显著。
为缩短试验过程,包被条件选择37℃10min烘干。
5.2封闭液和封闭条件的选择
包被抗原点样干燥后,分别用A、B、C、D四种不同配方的封闭液进行封闭,其他条件不变,观察点样点和NC膜的显色情况。
封闭液筛选结果见表5。
表5封闭液筛选结果
封闭液
显色情况
由表可知,封闭液B封闭后得到的斑点颜色很深,作为背景的NC膜呈白色,同斑点颜色反差非常大,说明封闭液B封闭效果很好,将NC膜上的一些结合位点进行了封闭,使金标抗体不在NC膜上结合停留,除抗原点样处为红色,NC膜其他位置都为白色。
封闭液A、C、D封闭后得到的斑点颜色也很深,但NC膜上呈深浅不一的粉红色,降低了斑点同背景的反差。
说明封闭液B封闭效果比其他三种封闭液封闭效果好。
包被抗原点样后,用封闭液B以不同的封闭时间10min、30min、45min、60min、120min分别在室温(20~25℃)、37℃条件下进行封闭,其它条件不变,观察显色情况。
表6封闭条件筛选结果
封闭时间(min)
60
120
37℃
室温(20~25℃)
封闭条件筛选结果见表6。
由表可知,看出抗原点样后,37℃和室温条件下封闭10~120min均能得到着色较深、背景较浅的斑点。
为缩短试验时间,37℃封闭10min。
5.3金标抗体稀释液的选择
20mL标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200µ
L浓缩金标抗体,分别用金标抗体稀释液A、B、C、D、E作2倍稀释后,滴加到经点样、封闭后的NC膜上,观察显色情况。
金标抗体稀释液筛选结果见表7。
表7金标抗体稀释液筛选结果
金标抗体稀释液
由表可知,其他条件相同的情况下,经稀释液A稀释后的金标抗体滴加到NC膜上得到的斑点颜色最深,最清晰。
L浓缩金标抗体,用金标抗体稀释液A分别作0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍稀释后,滴加到经点样、封闭后的NC膜上,观察显色情况。
金标抗体稀释倍数选择结果见表8。
表8金标抗体稀释倍数选择结果
稀释倍数
0.5倍
1倍
2倍
4倍
6倍
由表可知,浓缩纯化后的金标抗体作2倍稀释比较合适,单稀释倍数超过2倍后,NC膜上斑点颜色较浅或不显色。
6试纸条组成材料的选择
6.1用于胶体金免疫层析试验的膜多为硝酸纤维素膜(NC膜),对NC膜的选择常有以下要求:
6.1.1蛋白结合力:
NC膜与蛋白质结合的机理是静电引力。
胶体金免疫层析试验用的NC膜IgG的结合力常为100~180µ
g/cm2。
6.1.2孔径大小:
孔径大小是一个关键因素,免疫层析试验使用的膜孔径多为0.5~1.0µ
m。
6.1.3层析速率:
层析速率可用两种方式表示,单位时间层析流动的距离(cm/min)和单位长度层析流动所需时间(s/4cm)。
本试验供筛选的3种NC膜的层析速率见表9:
表9NC膜的层析速率
膜的类型
层析速率(s/4cm)
厚度(µ
m)
AE100
90~120
AE98Fast
110~160
CN140
130~150
6.1.4膜的厚度:
厚度对层析速率影响不大。
6.1.5抗张强度:
膜的可拉伸强度和弹性范围,如果膜的抗张强度太低在制备过程中会出现类似于断膜等许多问题。
6.2硝酸纤维素(NC)膜的选择
6.1.1用包被抗原在AE100、AE98Fast、CN140三种NC膜上分别点样,干燥、封闭后再分别滴加金标抗体溶液,比较不同膜的显色情况。
6.1.2用AE100、AE98Fast、CN140三种NC膜分别组装试纸条,比较不同膜的层析速度,比较相同时间内不同膜上检测线的显色情况。
表10NC膜点样显色结果
NC膜型号
由表可知,不同NC膜点样显色颜色都很深,没有明显区别。
6.1.3不同NC膜组装的试纸条试剂展开速度和加样5min后的检测线显色结果见表11。
表11NC膜层析显色结果
试剂展开速度(s)
64
71
139
5min后检测线显色情况
由表可知,AE100试剂展开速度较快,5min内检测线显色较浅,AE98Fast、CN140试剂展开速度较慢,AE100上检测线显色比AE98Fast上检测线显色深,且背景颜色很浅,三种膜中,AE100更符合试纸条设计要求。
6.2其他材料的选择
金标垫多采用玻璃纤维素等蛋白质吸附性低的纤维素膜。
样品垫多采用玻璃纤维或纤维素滤膜,玻璃纤维吸收量小,一般用于测定血液制品,纤维素膜吸收量大,一般用于尿样或大量体液的检测,并可在其中加入一定的封闭剂或增稠剂以优化试验过程。
吸收垫多采用具有高吸水能力的纤维素滤膜,通过改变吸收垫的大小可以调整试验结束的时间。
背衬板用于支撑NC膜,一般为附有压力敏感胶的聚脂板或塑料板。
6.2.1结合释放垫的选择
将稀释好的金标抗体滴加在GLass33、GLass24,温箱烘干后,组装试纸条,比较不同玻璃纤维素膜上金标抗体的释放情况,比较NC膜上的检测线显色情况。
结果见表12。
表12结合释放垫选择结果
玻璃纤维素膜
GLass33
GLass24
金标抗体释放情况
释放完全
少量残余
检测线显色情况
由表可知,GLass24组装的试纸条上检测线较GLass33组装的试纸条上检测线颜色浅,检测完成后GLass24上有少量的金标抗体残余。
故选择GLass33作为结合释放垫。
6.2.2样品垫的选择
用CB-SB08、CB-SB06、CB-SB03组装试纸条,各滴加50µ
L的样品,7min后比较样品垫对样品的吸收情况,比较NC膜上的检测线显色情况。
结果见表13。
由表可知,3种样品垫都能完全吸收50µ
L样品,7min后CB-SB06组装的试纸条检测线显色较其他两种颜色深,故选择CB-SB06作为样品垫。
表13样品垫选择结果
样品垫型号
CB-SB08
CB-SB06
CB-SB03
样品吸收情况
吸收完全
6.2.3吸收垫的选择
用CottonLinters2668,CottonLinters300,CottonLinters900三种棉线纸张分别组装试纸条,比较各棉线纸张的厚度、对层析反应后样品溶液的吸收情况。
结果见表14。
表14吸收垫选择结果
吸收垫型号
2668
900
层析后溶液吸收情况
由表可知,3种吸收垫5min内都能将由NC膜层析过去的样品溶液吸收完全。
3种膜的厚度分别为:
0.90mm、1.83mm、2.59mm,考虑到GLass33、NC膜AE100的厚度,所以CottonLinters2668与试纸条的其他材料匹配较佳。
6.4金标抗体喷涂量的选择
结合释放垫上金标抗体的喷涂量对试纸条的灵敏度有很大的影响,但金标抗体的喷涂量不是一个固定不变的值。
胶体金标记抗体蛋白过程中,标记时胶体金溶液的pH值固定,稳定胶体金的最佳蛋白用量固定,标记时搅拌子转速固定,标记所用时间固定,但金标抗体在低温超速离心纯化后浓度有较大差异。
同样的转速,超速离心后有时离心管管底有致密黑色金颗粒贴壁,有时没有,这必然导致纯化后金标抗体浓度的不同。
不同批次的金标抗体在往结合释放垫上喷涂
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