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但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
∙Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高),GC含量在40%-60%
∙引物之间的TM相差避免超过2℃
∙引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
∙为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
∙Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp
∙引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
探针设计原则
∙探针位置尽可能地靠近上游引物
∙探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性
∙检测探针的DNA折叠和二级结构
∙Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%
∙探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'
G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
∙整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
∙为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
TaqmanMGB探针设计
∙探针的5’端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
∙Tm值应为65-67℃。
∙尽量缩短TaqmanMGB探针,但探针长度不少于13bp。
∙尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
∙原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。
因此,在进行SNP检测时,为了检测到突变子,即TaqmanMGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意:
为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可向3’端移动,但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行SNP检测。
反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点。
若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。
有几个突变,突变位点也应靠近探针的5’端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。
另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。
第三步:
寻找一家信赖的公司合成引物和探针,一般引物合成大家比较熟悉,而且价格也比较便宜(特别是这两年便宜了许多),而探针则相对来说贵了许多,一般Taqman探针合成在1000到5000元不等(不同的合成要求价钱不同)——而这只是标记价钱,序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步:
一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少,只是要加入Taqman探针,另外不同就是分步法的不同。
其中需要注意的是:
∙扩增酶最好选用热启动酶
∙引物和探针的浓度需要进行优化,有人建议从50nM开始,在50nM—900nM之间优化,一般为200nM(注意探针需要避光保存。
∙同样Mg+和酶量也需要进行优化,酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U(50ul)
∙DNA模板的添加量通常在100ng以下,因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲进行2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应,第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了,但是有时也需要进行优化。
第七步:
在进行数据分析的时候,通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式。
方程式的斜
度可以用来检查PCR的效率,对于100%PCR效率来说,一个理想的斜率是3.32。
最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100%(100%意味着在每个循环之后,模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。
所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99),这样才能认为实验的过程和数据是可信的。
使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。
大多数定量PCR仪都有这样一个软件,它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
这其中有两种基本的方法:
绝对定量和相对定量,研究人员需要根据自己的实验目的来选择。
绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率,没有确切的数字被检测道。
另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异,因此除了要制作标准曲线来进行定量外,还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。
β-actin和三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)是两种较常用的管家基因,另外还有cyclophilin,18srRNA,phosphoglyserokinase,beta-microglobulin,beta-glucronidase,hypoxanthineribosyltransferase,transferringreceptor等。
要注意这些基因可以被反应条件所影响,在设计定量表达研究时,保证初始对照基因的质量是必要的一步,而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。
还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏,关于扩增曲线,经验总结认为:
“1.总体看曲线拐点清楚,指数期明显,扩增曲线整体平行性极好,基线平无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.曲线指数期斜率,反应了扩增效率,越大说明扩增效率越高。
扩增效率越高,试剂灵敏度表现会越好。
3.基线,图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线,平直或略微下降是好试剂的表现,阴阳性清楚,不易误判。
如果有上扬趋势,有可能造成阴性标本误判。
4.曲线与曲线间平行性非常好,说明各反应管扩增效率相近,外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上,所以扩增效率越相近,定量的重复性和准确性就越好。
而扩增效率相近与否,反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。
5.低浓度曲线指数期明显,一方面不易出现假阴阳性误判,另一方面说明灵敏度高。
”
大家可以参考探讨。
(生物通:
张迪)
PCR引物设计原则之个人心得篇
记得当初写本科论文,感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了,但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多,在大多数情况下,我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
设计的目的是在两个目标间取得平衡:
扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理:
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。
总的说来,决定引物退火温度(Tm值)最重要的因素就是引物的长度。
有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时:
[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时:
62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
为了优化PCR反应,使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来,每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍,这样,大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率有关。
由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
②GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;
如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度,是DNA双链结合。
一对引物的退火温度相差4℃~6℃不会影响PCR的产率,但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的,可以在55℃~75℃间变化。
④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构,有助于选择模板。
实验表明,待扩区域自由能(△G)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时,用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候,一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现。
这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测,网址:
http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
选择Aligntwosequences(bl2seq),如下图。
BLAST的使用方法也十分简单,如下图所示。
将引物序列粘贴到1区,将靶DNA序列粘贴到2区,这两者可以互换的,并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能,所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。
如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号,这样就不用粘贴一大段的序列了。
最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。
因为它一次只能比较两条序列,那么一对引物就需要分开进行比对。
如果存在错配,还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。
在下一篇中将介绍一个软件,可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。
⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方,因此要防止错配就从这里开始。
3’端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
⑦引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构,这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
两引物之间不应该存在互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一般情况下,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大,因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括:
加酶切位点;
标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;
引入蛋白质结合DNA序列;
引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
额外的碱基或多或少会影响扩增的效率,还加大引物二聚体形成的几率,但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
很多时候PCR只是初步克隆,之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上,那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。
以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。
a添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。
一般酶切位点是六个碱基,另外在酶切位点的5’端还需要加2~3个保护碱基。
但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的,例如:
SalⅠ不需要保护碱基,EcoRⅤ需要1个,NotⅠ需要2个,HindⅢ3个。
其中,在原核表达设计引物时还有一些小技巧,大家可以参考:
《原核表达之实验前的分析》。
里面一些规则是所有表达都通用的。
有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切,这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率,见附录。
不过这种方法虽然方便但并不推荐。
有时候,就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想,同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。
一旦出现问题,分析起来更麻烦。
bLIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independentcloning,它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。
用LIC法制备的pET载体有不互补的12–15碱基单链粘端,与目的插入片段上相应粘端互补。
扩增目的插入片段的引物5'
序列要与LIC载体互补。
T4DNA聚合酶的3'
→5'
外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。
由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物,这种方法非常快速高效,而且为定向克隆。
c定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞,真是方便,哪个小子脑子这么聪明想出来的。
但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中,所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体,它的一端含有四个突出的碱基GTGG。
因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列,这样片段就可以“有方向”了。
dIn-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的,2004年在生物通可着实风光了一把,不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。
此技术就其步骤来说是及其方便的,不需连接酶,不需长时间的反应。
只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列,然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中,在室温下放置半个小时就可以进行转化了。
这种方法特别适合大批量的转化。
这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响,欢迎大家发email推荐给生物通。
说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。
如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应,比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升(它识别的是8个碱基,且全为GC),这样使另外一个引物的设计变得十分困难,因为一对引物间退火温度相差不宜太远。
因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。
在碰到这些情况的时候,我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则,要试一试才能知道能否行得通了。
(生物通谢菲)
引物设计的原则概述
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引物设计原则的几种概述
一、
1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。
6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
二、
1.典型的引物18到24个核苷长。
2.选择GC含量为40%到60%或GC含量与模板GC含量接近的引物。
3.设计5'
端和中间区为G或C的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4.避免引物对3'
末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。
5.避免3'
末端富含GC。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
6.避免3'
末端的错误配对。
3'
端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
3’最好以G或C结尾,防止AT的松散结合引起错配。
7.避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。
8.引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。
这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
两引物的Tm值相差不应大于5℃。
计算Tm有几种公式。
:
Tm=(g+C)*4+(a+T)*2
9.当在引物5’端添加酶切位点时要考虑:
a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点,b)如果PCR后直接酶切,不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基,不同的酶对于保护碱基的要求是不同的,如果不设计保护碱基,则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上,这时要注意Taq酶的选择若想在目的序列上附加上并不存在的序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物
5'
端而不影响特异性。
当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
三、
引物设计原则1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5-3方向的,Tm之间的差异最好控制在1度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。
如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧
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- 探针 设计