第5章 微生物的遗传变异与菌种选育Word格式.docx
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内,结果小白鼠患病死亡,并从小白鼠体内分离出活的SⅢ型菌。
格里菲斯称这一现象为转化作用(图5-1),实验表明,SⅢ型死菌体内有一种物质能引起RⅡ型活菌转化产生SⅢ型菌,这种转化的物质(转化因子)是什么?
格里菲斯对此并未做出回答。
1944年美国的埃弗雷(O.Avery)、麦克利奥特(C.
Macleod)及麦克卡蒂(M.Mccarty)等人在格里菲斯工作的基础上,对转化的本质进行了深入的研究。
他们从SⅢ型活菌体内提取DNA、RNA、蛋白质和荚膜多糖,将它们分别和
RⅡ型活菌混合均匀后注射人小白鼠体内,结果只有注射SⅢ型菌DNA和RⅡ型活菌的混合液的小白鼠才死亡,这是一部分
RⅡ型菌转化产生有毒的、有荚膜的SⅢ型菌所致,并且它们的后代都是有毒、有荚膜的。
由此说明RNA、蛋白质和荚膜多糖均不引起转化,而DNA却能引起转化。
如果用DNA酶处理DNA后,则转化作用丧失。
图5-1.
肺炎双球菌的转化现象
1.1.2.
噬菌体的感染实验
证明DNA是遗传物质,还可用T2噬菌体感染大肠杆菌的实验来证实。
1952年赫西(A.Hershey)和蔡斯(M.Chase)用32P043-和35S042-标记T2噬菌体,因DNA分子中只含磷不含硫,而蛋白质分子中只含硫不含磷。
故将T2噬菌体的头部DNA标上32P,其蛋白质衣壳被标上35S。
用标上32P和35S的T2噬菌体感染大肠杆菌,经短时间的保温后,T2噬菌体完成了吸附和侵入的过程。
将被感染的大肠杆菌洗净放入组织捣碎器内强烈搅拌,然后离心沉淀。
分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记,结果全部35S和噬菌体在上清液中,全部32P和细菌聚集在沉淀物中。
这说明在感染过程中
噬菌体的DNA进人大肠杆菌细胞中,它的蛋白质外壳留在菌体外。
进入大肠杆菌体内的T2噬菌体DNA,利用大肠杆菌体内的DNA、酶及核糖体复制大量T2噬菌体,又一次证明了DNA是遗传物质(图5-2)。
1.1.3.
烟草花叶病毒的拆开与重建实验
烟草花叶病毒(TMV)由蛋白质外壳和核糖核酸
(RNA)核心所构成,可以从TMV病毒分别抽提得到它的蛋白质部分和RNA部分,把这两个部分放在一起,可以得到具有感染能力的烟草花叶病毒颗粒。
1965年,美国的法朗克一康勒特(Fraenkel
Conrat)将烟草花叶病毒拆成蛋白质和RNA(该病毒不含DNA),分别对烟草进行感染实验,结果发现只有RNA能感染烟草,并在感染后的寄主中分离到完整的具有蛋白质外壳和RNA核心的烟草花叶病毒。
烟草花叶病毒有不同的变种,各个变种的蛋白质的氨基酸组成有细微而明显的区别,后来法朗克一康勒特又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开,在体外分别将甲病毒的蛋白质和乙病毒的RNA结合,将甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白质结合进行重建,并用这些经过重建的杂种病毒分别感染烟草,结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的RNA(图5-3)。
这一实验结果说明病毒蛋白质的特性由它的核酸(RNA)所决定,而不是由蛋白质所决定。
可见在这里同样证明了核酸(RNA)仍然是遗传物质的基础。
图5-2.
T2噬菌体感染试验示意图
到目前为止,发现只有一部分病毒(包括动物、植物病毒和噬菌体)的遗传物质是RNA,其他生物的遗传物质都是DNA。
图5-3.
病毒重组实验示意图
1.2.
DNA的结构与复制
1.2.1.
DNA的结构
现在我们已经知道,DNA是遗传物质的基础,那么,DNA为什么能起遗传作用,它又是怎么起作用的呢?
这与它的分子结构是密切相关的。
DNA又称脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic
acid),是一种高分子化合物,其基本单位是脱氧核苷酸,相对分子质量最小的为2.3×
104,最大的达1×
1010,比蛋白质相对分子质量(5×
103~5×
106)大。
沃森(Watson)和克里克(Crick)
于1953年由X射线衍射结构分析提出了DNA分子双螺旋结构理论和模型,认为DNA是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构.
(图5—5)。
多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定,一条从5’到3’,另一条从3’到
5’。
链间有螺旋型的凹槽,其中一条较浅,叫小沟;
另一条较深,叫大沟。
每条多核苷酸链上均有四种碱基:
A(腺嘌呤adenine)、T(胸腺嘧啶thymine)、C
(胞嘧啶cytosine)、G(鸟嘌呤guanine)有序地排列,它们以氢键与另一条多核苷酸链的四种碱基相连,A与T配对,C与G配对,这种由氢键连接的碱基组合,称碱基配对(图5-4)。
一个DNA分子可含几十万或几百万碱基对,相邻碱基对平面之间的距离为0.34nm,即顺中心轴方向,每隔0.34nm有一个核苷酸,以3.4nm为一个结构重复周期,包括10对碱基。
核苷酸的磷酸基与脱氧核糖在外侧,通过磷酸二酯键相连接而构成DNA分子的骨架。
脱氧核酸环平面与纵轴大致平行,双螺旋的直径为2.0nm。
图5-4.
DNA双螺旋结构中碱基配对示意图
此模型所描述的资料来自在相对湿度为92%时所得到的DNA钠盐纤维,这种DNA称为B型DNA(B-DNA),B-DNA双螺旋的二级结构既规则又很稳定,但不是绝对的,它在环境中不停地运动,如室温下DNA溶液中有部分氢键会断开,造成这些部位结构多变。
水溶液及细胞中天然状态DNA大多为B-DNA,但若湿度改变或由DNA钠盐变为钾盐、铯盐等则会引起构象的变化,形成A-DNA、C-DNA等构象。
此外还有Z-DNA,
Z-DNA结构是1979年由Rich提出的(图5-5),该模型的提出曾一度动摇过右手螺旋学说。
现已证明,左手螺旋Z-DNA只是右手螺旋结构模型的一个补充和发展。
B-DNA是活性最高的DNA构象,B-DNA变构成A-DNA后,仍有活性,但若局部变构为Z-DNA后活性明显降低。
图5-5.
两种不同形式的DNA
DNA除了具有右旋、左旋的双股螺旋结构外,后来科学家在实验室设计并合成了三股螺旋的DNA(图5-6),它由15-25个核苷酸组成的短链反义核酸绑到双股DNA中形成。
1992年我国科学家首先发现具有三股螺旋的天然DNA。
现三股螺旋的DNA的存在已被国际公认。
图5-6.
三股螺旋结构的DNA
一般而言,特定的种或菌株的DNA分子,其碱基顺序固定不变,这保证了遗传的稳定性。
如果DNA的个别部位发生了碱基排列顺序的变化,则会导致菌株死亡或发生遗传性状的改变。
在现代细菌分类鉴定中,通过测定G十C百分含量确定属、种或菌株。
基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。
它是DNA分子上一个具有特定碱基顺序,即核苷酸顺序的片断。
按功能可分三种:
第一种是结构基因,编码蛋白质或酶的结构,控制某种蛋白质或酶的合成。
但tRNA和rRNA基因不编码蛋白质。
第二种是操纵区,它的功能像“开关”,操纵三个结构基因的表达。
第三种是调节基因,它控制结构基因。
例如:
大肠杆菌三种有关利用乳糖的酶是由三个结构基因决定的。
先由调节基因决定一种阻抑蛋白封闭操纵区的作用,使三个结构基因都不能表达,阻抑了酶的合成。
当培养基中有乳糖时阻抑蛋白失活,不能封闭操纵区,因而结构基因得以表达,合成能利用乳糖的酶。
一个基因的相对分子质量大约为6×
l05,约有1000个碱基对,每个细菌约具有5000至10000个基因。
基因控制遗传性状,但不等于遗传性状。
任何一个遗传性状的表现都是在基因控制下的个体发育的结果。
从基因型到表现型必须通过酶催化的代谢活动来实现。
基因直接控制酶的合成,即控制一个生化步骤,控制新陈代谢,从而决定了遗传性状的表现。
1.2.2.
DNA的复制
菌株细胞在分裂之前,只有DNA十分精确地进行复制,才能保证微生物的所有属性都得到遗。
而DNA的独特的半保留式的自我复制能力,确保了DNA复制的精确性,并保证了一切生物遗传性的相对稳定。
DNA的自我复制大致如下:
首先是DNA分子中的两条多核苷酸链之间的氢键断裂,双螺旋解旋和分开,每条链分别作为模板合成新链,产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基排列顺序完全一样。
在此过程中,每个子代分子的一条多核苷酸链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的,又以氢键连接成新的双螺旋结构
(图5-7)。
DNA复制时,其双连首先解开,形成复制叉。
复制起点是固定的,表现为固定的序列,并识别参与复制起始的特殊蛋白质,复制叉移动的方向和速度虽是多种多样的,但以双向等速为主。
无论是真核生物还是原核生物,它们的DNA
图5-7.
DNA的复制方式
复制都是半保留、半不连续复制,复制过程都存在引发、延长和终止3个阶段,都必须有相应功能的蛋白质(如SSB)和酶(如DNA聚合酶)参与。
但真核生物每条染色体上都可以有多处复制起始点,而原核生物只有一个起始点;
真核生物的染色体在全部完成复制之前,各个起始点上的DNA的复制不能再开始,而在快速生长的原核生物中,复制起始点上可以连续开始新的DNA的复制,表现为虽只有一个复制单元,但可有多个复制叉。
1.2.3.
RNA
RNA(ribonucleic
acid)
又称核糖核酸,有四种类型:
tRNA、rRNA、mRNA和反义RNA。
它们均由DNA转录而成,和DNA很相似,不同的是以核糖代替脱氧核糖,以尿嘧啶(uracil,简称U)代替胸腺嘧啶(T)。
因此,RNA链中的碱基配对为:
A—U、U—A、G—C、C—G等四种。
tRNA叫转移RNA,是模板与氨基酸之间的接合体,其上有和mRNA互补的反密码子,能识别氨基酸及识别mRNA上的密码子,在tRNA—氨基酸合成酶的作用下具有转运氨基酸的作用。
其在蛋白质生物合成的起始作用中,在DNA反转录合成中及其他代谢调节中都起重要作用。
细胞内t
RNA的种类很多,每一种氨基酸都有其相应的一种或几种t
RNA。
rRNA即核糖体RNA
,它和蛋白质结合成的核糖体为合成蛋白质的场所。
rRNA
含量大,是构成核糖体的骨架。
大肠杆菌核糖体有三类rRNA
:
5SrRNA,16S
23RNA。
mRNA叫信使RNA,mRNA
上每三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这三个核苷酸就称为密码,也叫三联子密码。
mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的,贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递给蛋白质。
每一种多肽都有一种特定的
mRNA
负责编码,所以细胞内mRNA
的种类是很多的,但是每一种mRNA的含量又十分低。
反义RNA是能与DNA的碱基互补,并能阻止、干扰复制转录和翻译的短小
的RNA。
反义RNA起调节作用,决定mRNA翻译合成速度。
由mRNA、tRNA、反义RNA和rRNA协作合成蛋白质。
1.3.
遗传物质的存在形式
真核生物(人、高等动物、植物、真菌、藻类及原生动物)的遗传物质是DNA,其染色体由DNA和蛋白质等组成。
真核生物的染色体不止一个,少的几个,多的几十或更多,染色体呈丝状结构,细胞内所有染色体由核膜包裹成一个细胞核。
真核微生物染色体以外的DNA主要以细胞器形式存在,这些细胞器中的DNA常呈环状,细胞器DNA的含量只占染色体DNA的1%以下。
原核微生物的染色体往往只有一个,是由单纯的DNA或
RNA组成。
细菌和放线菌的遗传物质单纯由一条DNA细丝构成环状的染色体,拉直时比细胞长许多倍,为双链的DNA,与很少量的蛋白质结合,没有核膜包围,它在细胞的中央,高度折叠形成具有空间结构的一个核区。
由于含有磷酸根,它带有很高的负电荷。
原核微生物DNA的负电荷被Mg2+离子和有机碱:
精胺、亚精胺和腐胺等中和。
真核生物DNA的负电荷被碱性蛋白质:
组蛋白和鱼精蛋白中和。
病毒中的遗传物质是DNA或
RNA,为双链或单链,呈线状或环状,且病毒的核酸都不与蛋白质相结合。
原核微生物染色体外的DNA称为细菌质粒,例如原核生物中的性因子(F因子),抗药性因子(R因子)等,它们的DNA只占染色体DNA的一小部分。
2.
微生物的基因突变
在微生物中,突变是经常发生的,学习和掌握突变的规律,不但有助于对基因定位和基因功能等基本理论问题的了解,而且还为微生物选种、育种提供必要的理论基础,同时对于致癌物质的检测也有重要意义。
突变是指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化,它有两个意义:
一是指与野生型不同的个体所携带和传递的基因组变异结构,这种变异结构可以是基因水平的,也可以是染色体水平的;
突变的另一个意义是指上述变异结构发生的过程。
对微生物来讲,基因突变最常见,最重要,而由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起DNA的改变,则不属突变的范围。
在微生物纯种群体或混合群体中,都可能偶尔出现个别微生物在形态、生理生化或其他方面的性状发生改变。
改变了的性状可以遗传,这时的微生物发生变异,成了变种或变株。
2.1.
突变的类型
突变的类型是多种多样,从突变涉及的范围,可以把突变分为基因突变和染色体畸变。
在粗糙脉孢菌中,染色体畸变的研究已经相当深入了。
在电子显微镜下现在已经可以观察病毒的染色体畸变。
不过就遗传学研究较为深人的大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌等细菌以及其它多数微生物来讲,突变的研究主要是在基因突变方面。
下面就分类的依据不同,探讨一下突变的类型。
2.1.1.
从突变涉及范围,可以把突变分为基因突变和染色体畸变。
基因突变,又称点突变。
是发生于一个基因座位内部的遗传物质结构变异。
往往只涉及一对碱基或少数几个碱基对。
点突变可以是碱基对的替代,也可以是碱基对的增减。
前者可分为转换和颠换(图5-8)。
转换是指一种嘌呤—嘧啶对变为另一种嘌呤—嘧啶对,或一种嘧啶—嘌呤对变为另一种嘧啶—嘌呤对;
颠换是指一种嘧啶—嘌呤对变为另一种嘌呤—嘧啶对,或反过来一种嘌呤—嘧啶对变为另一种嘧啶—嘌呤对。
这两种碱基的替代突变改变了遗传密码的结构和该密码所编码的氨基酸。
碱基对的增减则造成增减变异点以后全部密码及其编码的氨基酸,所以称为移码突变。
图5-8.
各种类型的转换和颠换
(实线代表转换,虚线代表颠换)
染色体畸变
染色体畸变是一些不发生染色体数目变化而在染色体上有较大范围结构改变的变异,是由DNA(RNA)的片段缺失、重复或重排而造成染色体异常的突变。
其中包括以下变化:
一是易位,指两条非同源染色体之间部分相连的现象。
它包括一个染色体的一部分连接到某一非同源染色体上的单向易位以及两个非同源染色体部分相互交换连接的相互易位。
二是倒位,指一个染色体的某一部分旋转180度后以颠倒的顺序出现在原来位置的现象。
三是缺失,指在一条染色体上失去一个或多个基因的片段,这是造成畸变的缺失。
四是重复,指在一条染色体上增加了一段染色体片段,使同一染色体上某些基因重复出现的突变。
发生染色体畸变的微生物往往易致死,所以微生物中突变类型的研究主要是在基因突变方面。
2.1.2.
从突变所带来的表型的改变来讲,突变的类型可以分为以下几
类:
形态突变型
指细胞形态结构发生变化或引起菌落形态改变的那些突变类型。
包括影响细胞形态的突变型以及影响细菌、霉菌、放线菌等的菌落形态以及影响噬菌体的噬菌斑的突变型。
例如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无,菌落的大小,外形的光滑或粗糙及颜色的变异;
放线菌或真菌产孢子的多少,外形及颜色的变异;
噬菌斑的大小和清晰程度的变异等。
致死突变型
指由于基因突变而造成个体死亡的突变类型,造成个体生活力下降的突变型称为半致死突变型。
一个隐性的致死突变基因可以在二倍体生物中以杂合状态保存下来,可是不能在单倍体生物中保存下来,所以致死突变在微生物中研究得不多。
条件致死突变型
这类突变型的个体只是在特定条件,即限定条件下表达突变性状或致死效应,而在许可条件下的表型是正常的。
广泛应用的一类是温度敏感突变型,这些突变型在一个温度中并不致死,所以可以在这种温度中保
存下来;
它们在另一温度中是致死的,通过它们的致死作用,可以用来研究基因的作用等问题。
营养缺陷突变型
是一类重要的生化突变型。
是指某种微生物经基因突变而引起微生物代谢过程中某些酶合成能力丧失的突变型,它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长繁殖。
这种突变型在微生物遗传学研究中应用非常广泛,它们在科研和生产中也有着重要的应用价值。
抗性突变型
是指一类能抵抗有害理化因素的突变型,细胞或个体能在某种抑制生长的因素(如抗生素或代谢活性物质的结构类似物)存在时继续生长与繁殖。
根据其抵抗的对象分抗药性、抗紫外线、抗噬菌体等突变类型。
这些突变类型在遗传学基本理论的研究中非常有用,常以抗性突变为选择标记,特别在融合试验、协同转染实验中用得最多。
抗原突变型
是指细胞成分,特别是细胞表面成分如细胞壁、荚膜、鞭毛的细致变异而引起抗原性变化的突变型。
其它突变型
如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和数量以及对某种药物的依赖性等的突变型。
这几类突变型并不是彼此排斥的。
营养缺陷型也可以认为是一种条件致死突变型,因为在没有补充给它们所需要的物质的培养基上它们不能生长。
某些营养缺陷型也具有明显的形态改变。
例如粗糙脉胞菌和酵母菌的某些腺嘌呤缺陷型分泌红色色素。
所有的突变型可以认为都是生化突变型,最为常见的是营养缺陷型。
抗药性突变也是微生物遗传学中常用的一类生化突变型。
因为任何突变,不论是影响形态的或是致死的,都必然有它的生化基础。
突变型的这一区分不是本质性的。
2.1.3.
按突变的条件和原因划分,突变可以分为自发突变和诱发突变。
自发突变
是指某种微生物在自然条件下,没有人工参与而发生的基因突变。
在过去相当长的时间里,人们认为自发突变是由于自然界中存在的辐射因素和环境诱变剂所引起的。
然而深入研究表明这种看法不够完全。
绝大多数的自发突变起源于细胞内部的一些生命活动过程,如遗传重组的差错和DNA复制的差错,这些差错的产生与酶的活动相关联。
DNA复制是非常精确的,细菌的DNA多聚酶具有聚合3’至5’的外切功能,它可以切除掺入到合成链的3’端和样板链不互补的错配碱基。
通过这种复制中的校正作用,大大减少了碱基的错配,提高了复制合成的精确度。
根据计算,这种校正可以把复制错误减少到10-10/碱基对,即每复制1010碱基对,只发生一次错误的掺入。
细菌碱基组含有3×
l06碱基对,复制一次发生错误的机会是3×
10-4,假设基因的大小为l03碱基对,则可推算出细菌在一个增殖世代中,每个基因的突变率平均为10-7左右。
考虑到自发突变中的大多数是检测不出来的沉默突变,所以,对于多数可检突变来讲,自发突变率为10-8左右。
DNA复制中的碱基错配、跳格,DNA聚合酶结构变异等均是提高自发突变的原因。
在序列相似的DNA片段间的重组过程中,特别容易发生重组差错,从而造成一个或几个碱基的重复和缺失;
基因重组是由重组酶来催化的,重组酶结构的变异也会影响基因的自发突变率。
总之,各种DNA复制和基因重组过程有关的酶和蛋白,对维持生物基因自发突变率起着重要的,决定性的作用。
诱发突变
是利用物理的或化学的因素处理微生物群体,促使少数个体细胞的DNA分子结构发生改变,基因内部碱基配对发生错误,引起微生物的遗传性状发生突变。
凡能显著提高突变率的因素都称诱发因素或诱变剂。
物理诱变
利用物理因素引起基因突变的称物理诱变。
物理诱变因素有:
紫外线、X-射线、γ-射线、快中子、β-射线、激光和等离子等。
化学诱变
利用化学物质对微生物进行诱变,引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。
化学诱变的物质很多,但只有少数几种效果明显,如烷化剂、吖啶类化合物等。
复合处理及其协同效应
诱变剂的复合处理常有一定的协同效应,增强诱变效果,其突变率普遍比单独处理的高,这对育种很有意义。
复合处理有几类:
同一种诱变剂的重复使用,两种或多种诱变剂先后使用,两种或多种诱变剂同时使用。
定向培育和驯化
定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体,同时不断将他们进行移种传代,以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。
由于自发突变的变异频率较低,变异程度较轻,故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。
2.2.
基因突变的特点
在生物界中由于遗传变异的物质基础是相同的,因此显示在遗传变异的本质上也具有相同的规律,这在基因突变的水平上尤其显得突出。
自发性
由于自然界环境因素的影响和微生物内在的生理生化特点,在没有人为诱发因素的情况下,各种遗传性状的改变可以自发地产生。
稀有性
自发突变虽然不可避免,并可能随时发生,但是突变的频率极低,一般在10-6~10-9之间。
诱
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