高中生物复习选修3《现代生物科技专题》专题研修人教版word 版Word下载.docx

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1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。

重组DNA表达实验的成功

1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。

重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。

这个实验证明了①质粒不仅可以作为基因工程的载体，②重组DNA还可以进入受体细胞，③外源基因可以在原核细胞中成功表达，并实现物种之间的基因交流。

至此，基因工程正式问世。

第一例转基因动物问世

1980年，科学家首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因小鼠。

1983年，科学家又采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。

此后，基因工程进入了迅速发展阶段。

PCR故术的发明

基因工程问世后，1988年由穆里斯发明的PCR技术，使基因工程技术得到了进一步发展和完善。

1.1DNA重组技术的基本工具

我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉的培育，首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。

这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。

它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如，EcoRI、SmaI限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。

DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—黏性末端和平末端。

当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。

寻根问底：

根据你所掌握的知识，你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？

提示：

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。

限制酶就是细菌的一种防御性工具，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

生物技术资料卡：

限制酶的命名

用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪个生物中分离出来的。

例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；

如果它是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限制酶，则进一步表示成EcoRI。

DNA连接酶——“分子缝合针”

将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。

根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：

一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·

coliDNA连接酶；

另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。

这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

E·

coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。

而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。

DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？

为什么？

（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；

而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板；

而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。

因此DNA

连接酶不需要模板。

思考：

想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？

提示：

能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞中。

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我

复制能力的很小的双链环状DNA分子。

质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。

携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。

质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。

2.联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?

生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。

这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。

3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？

自然存在的质粒DNA分子并不完全具备作为运载体的条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

1.2基因工程的基本操作程序

求异思维：

你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？

第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。

第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。

第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

目的基因的获取

获取目的基因是实施基因工程的第一步。

目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。

目的基因主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。

从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。

如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。

也有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。

怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？

这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。

►寻根问底：

为什么要构建基因文库？

直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？

构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。

如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过

PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得。

也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。

但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

基因文库的构建

将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。

也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。

如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文

库。

文库类型

cDNA文库

基因组文库

文库大小

小

大

基因中启动子

无

有

基因中内含子

基因多少

某种生物的部分基因

某种生物的全部基因

物种间的基因交流

可以

部分基因可以

利用PCR技术扩增目的基因

PCR是多聚酶链式反应的缩写。

PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

通过这一技术，可以在短时

间内大量扩增目的基因。

PCR的原理和做法并不难，它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。

利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

扩增的过程是：

目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。

由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n,其中n为扩增循环的次数）。

上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。

此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，

并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。

启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。

终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。

终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。

标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。

将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简单吗？

如果这么做，结果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。

此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。

将目的基因导入植物细胞

将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。

农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。

当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。

根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

由于这种方法比较经济和有效，迄今为止，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得的。

除此之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。

基因枪法：

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子。

这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

花粉管通道法：

这是我国科学家独创的一种方法。

在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因）,使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，花粉管通道法是一种十分简便经济的方法。

将目的基因导入动物细胞

基本的操作程序是：

首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在l～3μm/mL；

然后，从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精），采用显微注射仪进行显微注射；

再将注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。

将目的基因导微生物细胞

由于原核生物具有一些其他生物没有的特点：

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。

大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：

首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。

第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

目的基因的检测与鉴定

首先，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。

检测方法是采用DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。

其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。

检测方法同样是采用分子杂交技术，与上述方法不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。

最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。

检测的方法与上述方法有所不同，是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。

除了上述的分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。

例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。

又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。

1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

答：

不可以。

因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因

等。

必须构建上述元件的主要理由是：

①生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；

②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；

③目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；

④为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；

⑤有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？

若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？

双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。

裸子植物对该菌也敏感。

近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。

根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。

这些酚类物质通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。

利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。

如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：

①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；

②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。

当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。

假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

基本操作如下：

①从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

②将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

③将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。

如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

④培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

拓展视野：

历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献

将PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”,则是中国科学家钱嘉韵完成的，是她发现并分离了耐高温的DNA聚合酶。

钱

嘉韵是我国台湾的科学家，她是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的。

知识拓展

1.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？

道理何在？

①基因的特点：

如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。

基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。

②要选择强启动子或组织特异性启动子。

启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。

如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。

③要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。

2.什么是分子杂交技术的显示带？

Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。

目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。

基本做法是：

第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；

第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；

第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；

第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；

第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。

Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。

它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与Southern杂交相同。

Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。

它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。

具体做法是：

第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；

第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；

第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；

第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。

如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

1.3基因工程的应用

一、植物基因工程硕果累累

植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等），以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。

1、抗虫转基因植物

对农业害虫的防治，大多是