生物技术制药Word下载.docx
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受体效应
多效性和网络性效应
检验的特殊性
生物技术制药的特征
高技术(精细和密集的复杂技术)
高投入(尤其是前期科研投入高)
长周期(参考我国药物研发和注册程序)
高风险
高收益
生物技术在制药中的应用
基因工程制药:
疫苗、抗体等
细胞工程制药:
动物细胞工程和植物细胞工程
发酵工程制药:
微生物药物
酶工程制药:
酶的催化和微生物转化
基因工程克隆载体的特点:
①具有复制子
②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点
③有选择性遗传标记如抗性基因
④拷贝数高
⑤生物安全性好
目前使用的载体按特性可分为:
①质粒
②λ噬菌体
③黏性质粒
④M13噬菌体
⑤酵母
⑥真核细胞病毒载体
质粒:
是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子,具有独立自主复制和调控能力,可赋予宿主细胞一定的生物性状。
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件
⑴载体能够独立复制。
载体本身是一个复制子,具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。
且克隆位点位于启动子序列后,以便外源基因表达。
⑶应具有很强的启动子,能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
⑸应具有很强的终止子,只转录克隆的基因,所产生的mRNA较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列,以便转录后顺利翻译。
基因工程(geneticengineering)*:
有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。
基因工程药物的主要类别
1.激素:
胰岛素,生长激素
2.免疫性蛋白:
单克隆抗体,疫苗
3.细胞因子:
干扰素,白细胞介素
4.酶类:
尿激酶,超氧化歧化酶
基因工程生产药物的优点
1.收获量大,更有效服务社会。
2.生产效率更高
3.进一步改良药理活性,例:
蛋白质工程
4.有利于获得新药:
筛选新型化合物
目的基因的获得
1.构建cDNA文库,然后从中调用目的基因;
2.聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段;
3.RT-PCR(反转录-PCR)合成目的DNA片段
4.对旧基因的改造
5.化学合成(短)基因
宿主菌的必要条件:
1.具有高浓度、高产量、高产率
2.利用廉价原料
3.不致病、不产生内毒素
4.发热量低、需氧低、发酵温度适当
5.易于代谢调控
6.易于DNA重组
7.产物分离纯化简单
常见的宿主菌
原核细胞:
大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌
真核细胞:
酵母、丝状真菌
大肠杆菌中的外源基因表达
1.真核基因在大肠杆菌表达载体的必备性质
2.表达载体——pBV220&
pETsystem
3.影响目的基因表达的因素
4.真核基因在大肠杆菌的表达形式
E.coli表达载体的6个必备性质
1.独立的复制子
2.多克隆位点
3.强启动子
4.强终止子
5.阻遏子
6.Shine-Delgarnosequence(SD序列)&
AUG
影响目的基因在E.coli表达的5大因素
1.基因的剂量
2.表达效率
a转录的强度,
b翻译效率(核糖体结合,SD序列,condonbias:
密码子偏爱)
3.表达产物的稳定性:
4.宿主E.coli的代谢负荷
5.工程菌的培养条件
真核基因在E.coli表达形式
⑴以融合蛋白的形式表达药物基因融合蛋白:
以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。
(与原核多肽使用同起始密码和终止密码)
优点:
操作简便,表达蛋白在菌体内稳定,可高效表达;
缺点:
只能作抗原用。
⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因
非融合蛋白:
在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始,在其氨基端不含细菌多肽序列。
保持原有蛋白活性;
易被蛋白酶破坏。
⑶分泌型表达药物基因
在周质中稳定,有活性,不含蛋氨酸残基,易于分离纯化。
产量不高,信号肽不被(在特定位置)切割。
以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆
将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤:
a.获得目的基因和质粒载体;
b.形成重组质粒;
c.制备感受态细胞,用重组质粒转化大肠杆菌细胞;
d.培养大肠杆菌,让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝;
e.筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞,进行检查或鉴定。
酵母体系中的基因表达载体:
A.酵母载体类型
YEp(yeastepisomalplasmid,酵母附加体质粒)
YRp(yeastreplicatingplasmid,酵母复制型质粒)
YCp(yeastcentromericplasmid,酵母着丝粒质粒)
Yip(yeastintegrativeplasmid,酵母整合性质粒)
B.克隆载体与穿梭载体
影响目的基因在酵母表达的因素
1.外源基因的剂量
2.外源基因的表达效率
①启动子的来源
②终止子的有效性
③分泌信号的效率
3.外源蛋白质的糖基化
4.宿主菌株的影响
生长能力、内源蛋白酶、菌株性能、分泌能力
基因工程药物生产路线
(1)获得目的基因;
(2)与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子;
(3)用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受
体细胞中复制和遗传;
(4)对转化子筛选和鉴定;
(5)对获得外源基因的细胞或生物体通过培养,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
(6)分离纯化产物、除菌过滤、鉴定、包装
乙酸是怎么产生的
生物体的代谢:
合成代谢(需要能量)、分解代谢(释放能量)
生物体获得能量的途径*:
1.呼吸作用所产生的ATP
2.TCA循环(柠檬酸循环)产生的ATP
乙酰辅酶A为TCA循环的起止点
3.辅助形式:
乙酰-CoA乙酸+ATP
控制乙酸产生的方法
1.分批培养:
选择不同的碳源
2.补料培养:
控制补料速度
3.连续培养:
控制稀释速率
4.加入蛋氨酸(提高菌体有氧代谢能力)和酵母提取物(减少葡萄糖的摄取)
实质:
控制菌体的糖酵解(EMP)速度,使之低于TCA循环和呼吸链的最大代谢能力,从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生。
菌体生长与前体供应的关系
前体*:
细胞从外界吸收的或在代谢途径中形可被进一步转变成大分子产物的化合物。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,导致工程菌生长速率降低。
质粒存在对菌体代谢的影响
中等拷贝质粒(56拷贝):
与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。
高拷贝质粒(240拷贝):
生长速率和菌体总蛋白合成均减少。
这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生的“严紧反应”有关。
基因工程菌的不稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性。
质粒不稳定可分为*:
分裂不稳定、结构不稳定
分裂不稳定:
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。
即整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸(curing)。
结构不稳定:
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
一、质粒不稳定产生的原因*
常见分裂不稳定的两个因素:
⑴与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。
⑵含有与不含质粒的两种菌比生长速率差异的大小。
即丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势,在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。
常见结构不稳定的因素:
1.质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关,具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失;
2.在无同源性的两个位点之间也会发生缺失;
3.培养条件也会对质粒结构不稳定产生影响。
二、提高质粒稳定性的方法
1、选择合适的宿主菌
宿主菌的遗传特征
宿主菌的比生长速率
基因重组系统的特征
染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列
2选择合适的载体
载体的拷贝数低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高,增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性;
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低,但对稳定性不利。
对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数。
3选择压力
在培养基中加选择性压力抗生素,可以抑制质粒丢失菌的生长。
添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力。
大规模生产时不可取。
4分阶段控制培养
第一阶段先使菌体生长至一定的密度,使质粒稳定地遗传,第二阶段诱导外源基因的表达,由于第一阶段外源基因未表达,减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别,增加了质粒稳定性。
5控制/优化培养条件
通过调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、限制性营养物质来控制比生长速率。
6固定化
不同的宿主菌及其质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。
基因工程菌中试
中试是以实验室研究(上游)为基础,为大量生产(下游)铺垫的阶段。
中试的目的:
1.临床试验
2.摸索大量生产的条件/参数
中试应考虑的问题
一、工程菌选择
二、发酵罐设计
三、发酵培养基组成
四、工艺最佳化与参数(主要参数、生物量、碳源、产品)监测控制
五、计算机的应用
六、产品提取和纯化
基因工程菌的培养方式
分批培养:
为了保持基因工程菌生长所需的良好微环境,延长其生长对数期,获得高密度菌体,通常把溶氧控制和补料措施结合起来,根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
补料分批培养:
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的方法
连续培养:
将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至菌体浓度达一定程度后,开动进料和出料蠕动泵,以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境。
透析培养:
利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离,其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响
固定化培养:
将细胞限定或固定在一定的空间内,可以提高工程菌的稳定性,提高质粒的稳定性,便于进行连续培养。
最佳化工艺的综合指标
最快周期、
最高产量、
最好质量、
最低消耗、
最大安全性、
最周全的废物处理效果、
最佳速度和
最低失败率等。
基因工程菌对发酵罐的特殊要求
提供菌体生长最适生长条件,
培养过程不得污染,
保证纯菌培养,
培养及消毒过程不得游离出异物,
不能干扰细菌代谢活动等。
高密度发酵:
指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上,理论上的最高值可达200gDCW/L。
(DCW:
drycellweight)
单个菌株的外源基因表达量不变
高密度发酵的意义
降低生产成本、提高生产效率
提高发酵罐内的菌体密度
提高产物的细胞水平量
相应的减少了生物反应器的体积
提高单位体积设备生产能力
降低生物量的分离费用
缩短生产周期
影响高密度发酵的因素
培养基;
溶氧浓度;
pH;
温度;
代谢副产物
1培养基:
高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高。
如碳源和氮源的比例:
偏小,会导致菌体生长旺盛,造成菌体提前衰老自溶;
偏大,则菌体繁殖数量少,细胞代谢不平衡,不利于产物积累。
2溶氧浓度
菌体在扩增过程中,需要大量氧进行氧化分解代谢,饱和氧的及时供给非常重要。
随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降,细胞的生长减慢。
特别是高密度发酵的后期,由于菌体密度的扩增,耗氧量极大,发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给,导致菌体生长极为缓慢,外源蛋白的表达量也较差。
在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度,必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度
3pH
大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气,特别是大量的乙酸和二氧化碳,使pH降低,必须调节pH在适宜的范围。
4温度
培养温度在适宜的范围,对于温控诱导表达的基因工程菌来说,诱导时机和持续时间对于重组蛋白的产量有很大影响。
5代谢副产物
乙酸;
二氧化碳
为降低培养基中代谢副产物的积累,可采用流加补料的措施,或保持适当的比生长速率,或在培养基中添加某些氨基酸。
实现高密度发酵的方法
1发酵条件的改进
①培养基的选择:
采用甘油作为碳源
②建立流加式培养:
营养过高抑制细胞生长,高密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的,营养物是在需维持高生长速率是才添加的。
③提高供氧能力:
通入空气与氧混合气体;
增加压力;
发酵液中添加过氧化氢。
2构建产生乙酸化能力低的工程化宿主菌
通过发酵条件的改进可以减少乙酸的产生,但是难以做到精细的调控,通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径,构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌,是从根本上届均问题的途径之一。
①阻断乙酸产生的主要途径:
基因敲除或突变产生乙酸代谢突变菌株。
②对碳代谢流进行分流:
丙酮酸代谢有选择的向乙醇的方向进行。
③限制进入糖酵解途径的碳代谢流:
大肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶系统的作用下通过基团转位的方式进行的,通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取速率。
④引入血红蛋白基因:
提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率。
3构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言,随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积,目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。
基因工程药物或生物技术产品特点:
(1)目的产物在初始原料中的含量较低;
(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等,特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大;
(3)目的产物的稳定性差,具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感,容易失活、变性;
(4)种类繁多,包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物,以及结构复杂又性质各异的生物活性物质;
(5)应用面广,对其质量、纯度要求高甚至要求无菌、无热源。
分离纯化的技术要求
(1)技术条件要温和,能保持目的产物的生物活性;
(2)选择性要好,能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来,达到较高纯化倍数;
(3)收率要高;
(4)两个技术之间要能直接衔接,不需要对物料加以处理或调整,这样可减少工艺步骤;
(5)整个分离纯化过程要快,能够满足高生产率的要求
分离纯化工艺应遵循的原则
1)具有良好的稳定性和重复性;
2)尽可能减少组成工艺的步骤;
3)组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调,工艺和设备相适应
4)在工艺过程中尽可能少用试剂,以免增加分离纯化步骤,或干扰产品质量;
5)分离纯化工艺所用的时间尽可能短,尤其是对稳定性差的产物;
6)工艺和技术必须高效,收率高,易操作,对设备条件要求低,能耗低;
7)具有较高的安全性。
细胞的破碎方法
物理法:
匀浆法,利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀后,因高速撞击和突然减压而使细胞破裂的方法。
(可以大规模应用,不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌”)
珠磨法,将细胞悬浮液与研磨剂一起快速搅拌或研磨,利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出内含物。
(产生大量的热,必须采取冷却措施)
超声法,利用超声波来处理细胞悬浮液,在超声波作用下,液体发生空化作用,空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。
(可处理少量样品,产生热量大,敏感物质易失活。
)
化学法:
渗透冲击,先将细胞置于高渗透压介质,达成平衡后,突然稀释介质,在渗透压的冲击下,使细胞壁和膜膨涨破裂。
(适用于细胞壁较脆弱的,经过酶处理的细胞壁。
增溶法,利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用,增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。
(表面活性剂:
SDS;
TritonX-100,有机溶剂:
乙醇;
异丙醇,尿素、EDTA)
生物法:
酶溶法,利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。
(细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,必须根据待处理细胞的结构和化学组成来选择适当的酶,并确定相应的使用次序。
价格高,回收利用困难,仅在实验室用。
凝胶层析
指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时,因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。
又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。
优点:
设备简单,操作方便,分离效果好,回收率高,分离条件缓和,不使活性物质失活变性,凝胶可重复使用,无需再生处理。
缺点:
分离速度慢。
包含体:
是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。
包含体对于重组蛋白的产生的优势
1、富集目标蛋白:
包含体具有高密度,易于分离纯化的优势;
2、抗蛋白酶:
重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解;
3、对宿主毒性小:
生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。
(但是,其复性率低!
包含体的溶解
一般用强的变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl6M),通过离子间的相互作用,打断包含体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展。
或用去垢剂,如SDS、TritonX-100、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包含体蛋白质。
生物活性测定
需通过动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定
产品的保存
防止变性,降解,保护其活性中心。
⒈液态保存
(1)低温保存:
液态蛋白质样品在-10~-20°
C以下冰冻保存。
(2)在稳定pH条件下保存:
蛋白质较稳定的pH一般在等电点,且多数蛋白质只有在很窄的pH范围内才稳定。
因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的PH范围内。
(3)高浓度保存:
一般蛋白质在高浓度时比较稳定,因为液态蛋白质容易受水化作用的影响,浓度太低易引起亚基解离和表面变性。
(4)加保护剂保存:
多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。
⒉固态保存:
一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。
含水量降到5%时,在室稳或冰箱中保存均比较稳定,但在37℃保存时活性明显下降。
长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。
冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性,放在干燥器中在4℃可保存相当长的时间。
离体培养的细胞分为两类:
1、贴壁细胞:
细胞生长须有贴附的支持物表面,自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。
(Hela细胞;
巨噬细胞;
神经细胞)
2、悬浮细胞:
生长不依赖支持物表面,在培养液中呈悬浮状态生长。
细胞为圆形。
(淋巴细胞;
血液白细胞)
3、兼性贴壁细胞:
生长不严格依赖支持物。
形态:
上皮样,成纤维样,圆形(中国地鼠卵巢细胞;
小鼠L929细胞)
融合细胞系
细胞融合:
两个或者两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。
融合细胞:
动物+动物;
动物+植物
融合方法:
仙台病毒融合法;
聚乙二醇融合法;
电融合法
基因载体导动物细胞常用方法:
磷酸钙沉淀法:
溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀,DNA被包在磷酸钙沉淀中,形成DNA—磷酸钙共沉淀物,当和细胞表面接触时,则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
电穿孔法:
借助电穿孔仪的高压脉冲电场,使细胞膜出现瞬时可逆性小孔,外源DNA沿小孔进入细胞。
转化率较高,拷贝数低。
动物细胞培养基的种类和组成
1、天然培养基:
血清、羊水、腹水等。
(成分复杂、成分不稳定。
2、合成培养基:
明确的化学试剂配置成,适于重复实验。
(DME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640)
合成培养基成分:
①氨基酸:
至少12种(R胱HILKMFTWYV),L型aa。
②维生素:
辅酶或辅基
③糖类:
能量
④无机盐:
保持渗透压
⑤其它成分:
添加小牛血清
添加小牛血清的作用:
①提供生长因子和激素
②提供贴附因子和伸展因子
③提供可识别金属、激素和维生素的结合蛋白
④提供必需脂肪酸和微量元素
⑤提供良好的pH缓冲系统。
3、无血清培养基
①提高重复性
②减少微生物污染
③供应充足稳定
④产品易纯化
⑤避免血清因素对细胞的毒性
⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰
无血清培养基加入的添加剂种类:
①生长因子和激素
②结合蛋白
③贴附因子和伸展因子
④有利细胞生长的因子和元素
悬浮培养(suspensionculture)
让细胞自由地悬浮于培养基内进行生长繁殖。
适用细胞类型:
一切种类的非贴壁依赖性细胞,兼性贴壁细胞。
设备:
通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。
生产药物:
单克隆抗体;
干扰素。
操作简单,培养条件均一,传质和传氧效果好,容易大规模培养。
细胞体积小,且处于悬浮状态,难采用灌流培养,细胞密度低。
贴壁培养
必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。
一切贴壁依赖型细胞,兼性贴壁细胞。
基质要求:
具有净阳电荷和高度表面活性。
对微载体而言还要求具一定电荷密度。
A容易更换培养液,细胞紧密黏附于固相表面,可直接倾去旧培养液,清洗后直接加入新培养液。
B容易采用灌流培养,从而达到提高细胞密度的目的,因细胞固定表面,不需过滤系统。
C当细胞贴壁于生长基质时,很多细胞将更有效的表达一种产品。
D适用的细胞类型范围广。
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