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3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
问题3:
拖尾
产物在凝胶上呈Smear状态。
1.模板不纯
2.Buffer不合适
3.退火温度偏低
4.酶量过多
5.dNTP、Mg2+浓度偏高
1.纯化模板
2.更换Buffer
3.适当提高退火温度
4.适量用酶
5.适当降低dNTP和镁离子的浓度
问题4:
假阳性
空白对照出现目的扩增产物
靶序列或扩增产物
的交*污染
1.操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
2.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存
琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物
一.原理
DNA片断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术,例如可收集特定酶切片断用于克隆或制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率:
前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应;
后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。
本实验采用的是V-GENE公司的DNA凝胶回收试剂盒,其原理是:
在凝胶融化液(BufferDE-A)中凝胶块被迅速融化并释放出DNA。
加入高离液序列溶液(BufferDE-B)后DNA片断被选择性吸附到silica膜上。
经BufferW1、BufferW2洗涤去除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后,吸附到silica膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来,即可用于各种分子生物学实验。
二.材料与方法
1材料
PCR产物(未经纯化)
2仪器、用具
电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器(55-65℃)、1.5ml离心管
3试剂
1×
TAE电泳缓冲液;
溴化乙锭溶液(EB)[有毒,小心操作];
琼脂糖;
6×
加样缓冲液;
NJ缓冲液;
DNA洗脱缓冲液;
SPW洗涤缓冲液
2.4方法
(1)按常规方法于2%琼脂糖凝胶进行电泳。
(2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面液体。
(3)称量凝胶重量,以1mg=1μl换算凝胶体积。
(4)加入3个凝胶体积的NJ缓冲液
(5)悬浮均匀后于55℃-65℃加热7min,期间每2—3min摇晃一次,直至凝胶块完全融化。
(6)把DNA—琼脂糖溶液加到一个Mu-PuDNA回收纯化柱上,并把柱子装在一干净的2ml收集试管内,14000rpm离心1ml,弃去流出液。
*对于体积大于700μl的样品,则分别加到不同的柱子上,每次700μl。
(7)用700μl无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液洗涤柱子,加入柱子中后静置2-3min。
室温下14000rpm离心1min。
(8)弃滤液,以同样的方法再洗涤一次。
(9)把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上,加入30-50μl的DNA洗脱缓冲液或无菌去离子水到柱基质上,14000rpm离心1min以洗脱出DNA。
(10)取3μl样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。
注:
PCR产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于PCR产物。
若PCR产物电泳时为单一条带,可采用直接纯化法,即将酶、dNTP等多余物质去掉便可;
若PCR产物电泳时为多条带,则要根据需要回收特定条带,此时须选用胶回收法。
琼脂糖凝胶电泳实验技巧-入门
琼脂糖凝胶电泳实验技巧
核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液(pH8.0-8.3)中,基其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因而带负电荷,电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分了,使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多实验的要求。
因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
一、操作过程中要注意以下一些问题。
1、凝胶制作
1.1凝胶浓度
凝胶的浓度据实验需要而变,一般在1.8%-2.0%之间,没有用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定。
补水办法:
一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充水分到原刻度;
二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值,以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
如果条带要回收最好不要用回收胶。
1.2梳板的选用
一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。
梳齿宽厚,形成的点样孔容积较大,用于DNA片段回收实验等;
相反,梳齿窄而薄,形成的点样孔容积就较小,用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来,形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定。
一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析。
另外,每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。
当然,点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块入4度冰箱中冷却15min左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孔。
2、点样
在样品加入上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使样品沉入孔底;
上样缓冲液中一般还含有两种指示剂,溴酚兰和二甲苯菁,用于指示样吕的迁移过程。
上样缓冲液储存液一般为6倍(10倍),表示其浓度为工作浓度的六倍。
使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。
点样方法是将移液枪基本垂直对准点样孔,用另一只手帮助固定移液枪下端,移液枪的枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内。
上样量的多少根据跑胶的目的而不同,一般直接跑DNA时量最少,跑一般的分子标记适中,回收时可以都加进去。
最后根据扩增条带的大小点上适合的DNAMaker。
3、电泳
将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连,每次电泳时都要检查一下电极方向,以免白干(新手来做时可能就有这样的情况发生)。
核酸带负电荷,从负极向正极移动。
电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好浸过胶为好。
电泳缓冲液浓度太大则电流加大,凝胶发热,易使DNA降解。
电泳早所加电压一般不超过5v/cm(正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度)。
电泳时间一般为30-60min,根据实验需要也可作适当调整。
电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;
相反,电压降低,电泳时间较长,条带会相对的清晰。
另外,如果电泳后样品泳支很慢或者没移动可能是由于挡板没有拿开。
附EB作用原理:
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。
它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。
在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。
当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。
这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。
这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。
由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml)时,可以检测到少至10ng的NDA条带。
琼脂糖凝胶电泳
电泳技术概述
编辑本段
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。
于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。
最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。
在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。
这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分:
电源和电泳槽。
电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。
电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。
垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。
电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm
14cm,厚度为1mm~2?
mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。
制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。
水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。
由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。
在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),L是电极间距离。
在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积。
这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。
粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:
F’=6πrηυ式中r是球状分子的半径,η是缓冲液粘度,υ是电泳速度(υ=d/t,单位时间粒子运动的距离,cm/s)。
当带电分子匀速移动时:
F=F’,q?
E=6πrηυ由此可以看出,迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时,实际使用的是相对迁移率mR。
带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。
即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。
有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳;
而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分离后的样品通过各种方法的染色,或者如果样品有放射性标记,则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。
琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。
琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。
琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。
尽管琼脂糖本身没有电荷,但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代,使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,尤其适合于核酸的提纯、分析。
如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的阻碍作用较小,这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术,如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。
琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析,由于DNA、RNA分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用,这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。
另外,一些低熔点的琼脂糖(62C时熔化,因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差,难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳,管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。
琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DNA、RNA的分析。
垂直式电泳应用得相对较少。
目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下:
1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳。
2)琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98%~99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。
3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
4)电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
核酸电泳指示剂的选择
指示剂:
核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色,它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有:
1、增加样品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内。
2、在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度和位置。
3、使样品呈色,使加样操作更方便。
染色剂:
核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,最常用的是溴化乙锭染色法,其次是银染色。
溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min.琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般>
5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA不宜回收。
琼脂糖凝胶电泳过程
主要试剂:
核酸电泳缓冲液有三种,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解。
核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有:
1)TBE:
0.08mol/lTris·
HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/lEDTA
2)THE:
0.04mol/lTris·
HCl。
pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/lEDTA
主要实验步骤:
1、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上,并架好梳子。
2、取5×
TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×
TBE稀释缓冲液,待用。
3、胶液的制备:
称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×
TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
4、胶板的制备:
将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。
将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×
TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
琼脂糖浓度的配置可参照下表:
琼脂糖浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.9~6
1.5
0.2~3
12.0
0.1~2
5、样品制备与加样:
溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料(0.025%溴酚蓝或桔黄橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用2.5%FicoⅡ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样5-10μg。
6、电泳:
一般电压为5-15V/cm。
对大分子的分离可用电压5V/cm。
电泳过程最好在低温条件下进行。
7、样品回收:
电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗脱法:
在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋(内含适量新鲜电泳缓冲液),扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来。
吸出含DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。
注意事项:
1、加热时,一定要煮沸,以保证琼脂糖的完全溶解。
2、待溶液冷却至不烫手,感觉温暖舒适时加EB.一定要在通风柜里。
3、倒胶时,可用干净的纸巾拭去气泡。
4、胶凝固后先倒入些电泳缓冲液以方便取梳子。
5、保证缓冲液淹过胶的边沿,边沿部分常高出1-2mm。
6、有时需要大的上样孔,可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起,这种情况下,尽量让胶液冷一些再倒胶。
7、如果只是为了看一下结果(不需要照相),同一块胶可重复用1-3次.有一次我跑了4遍,条带很弱,用加了EB的缓冲液(约10ulEBin50ml缓冲液)泡半小时后就如正常了。
8、要保存胶到第二天用,可以保鲜膜包裹后放入4度冰箱。
9、TAE电泳缓冲液也可重复使用,至少10次没有问题。
10、为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变,可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液,混匀后再用。
琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项
DNA分子带负电,从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动,速度依赖于其分子质量。
小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。
依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度,例如质量浓度3mg/ml的琼脂糖用来做DNA大片段电泳(>
20000碱基)而0.8%只能电泳小的片断。
要注意以下几点:
1、用移液抢将样品加至点样孔。
每孔点样的体积一般少于25ul,因此吸取每一个样品时,操作要稳当且细心。
2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度,以使每个样品停留在各自的点样孔中。
3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料(如溴酚蓝),用以看出样品移动的距离。
4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品,电泳结束后,根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。
5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。
注意电泳期间,电泳槽盖要安全盖好,以防止液体蒸发,又可以降低电击的可能性。
6、电泳结束后,将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭(EB)中,5min后即可看到DNA带,EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。
另一种方法是电泳时,在胶中加入EB。
7、在紫外灯下,由于EB发出强烈的橘红色的荧光,所以可以看到DNA带。
利用这种方法检测的界限是每条带约10ngDNA。
带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。
可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。
同样,利用特制的照相机和调焦器,也可以对凝胶拍照。
8、如果要对某一条带(如质粒)进一步分析,可用小刀将含该带的凝胶切割下来,从带中回收DNA。
其他注意事项:
1、琼脂糖:
不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
2、凝胶的制备:
凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液:
为保持电泳所需的离子强度和pH,应常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量:
一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5μg的
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