腊肉从原料到餐桌的微生物检验范文Word下载.docx
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磷酸钠、六偏磷酸钠和三聚磷酸钠GB1890—2005
酸度计:
精度,02pH单位,配有饱和甘汞电极和玻璃电极,氟电极电位计,磁力搅拌器。
c.增稠剂:
明胶和卡拉胶GB15044—1994
离心管、电炉、红外吸收光谱仪。
d.防腐剂:
山梨酸GB/T5009.29—2003
e.着色剂:
高梁红GB9993—2005.红曲米GB4929—1985,红曲红GB15961—2005
分光光度计、微量注射器或色素吸管、展开槽,25X6x4cm4、层析缸、滤纸、中速滤纸,纸色谱用、薄层板:
5X20em
、电吹风机
、水泵
3、微生物检验
(1)菌落总数按GB/T4789.2-2010规定的方法检
天平、培养箱、显微镜、均质器。
(2)乳酸菌按GB/T4789.35-2010规定的方法检
天平、培养箱、显微镜、均质器、水浴锅。
(3)大肠杆菌按GB/T4789.3-2010规定的方法检验
(4)沙门氏菌。
按GB/T4789.4-2010规定的方法检验
(5)志贺氏菌。
按GB/T4789.5-2011规定的方法检验
(6)金黄色葡萄球菌。
按GB4789.10-2010规定的方法检验
天平、培养箱、显微镜、离心机、均质器。
(7)酵母菌和霉菌。
按GB4789.15-2010规定的方法检验
4、检验指标和合格要求
项目
指标
水分(%)
≤25
食盐(%,以NaCl计)
≤10
铅(Pb),mg/kg≤
0.5
无机砷,mg/kg≤
0.05
镉(Cd),mg/kg≤
0.1
汞(以Hg计),mg/kg≤
亚硝酸盐(以NaNO2计),mg/kg≤
30
过氧化值(以脂肪计),g/100g≤
0.25
大肠菌群,MPN/100g≤
致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)
不得检出
注:
净含量应符合国家质量监督检验检疫总局第75号令《定量包装商品计量监督管理办法》的规定。
样品的菌落总数的检验
(一)选择检验方法:
食品安全国家标准
食品微生物学检验菌落总数测定
1范围
本标准规定了食品中菌落总数(Aerobicplatecount)的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2术语和定义
2.1菌落总数aerobicplatecount
食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1恒温培养箱:
36℃±
1℃,30℃±
1℃。
3.2冰箱:
2℃~5℃。
3.3恒温水浴箱:
46℃±
3.4天平:
感量为0.1g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管:
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
3.8无菌锥形瓶:
容量250mL、500mL。
3.9无菌培养皿:
直径90mm。
3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.11放大镜或/和菌落计数器。
4培养基和试剂
4.1平板计数琼脂培养基:
见附录A中A.1。
4.2磷酸盐缓冲液:
见附录A中A.2。
4.3无菌生理盐水:
见附录A中A.3。
5检验程序
菌落总数的检验程序见图1。
6操作步骤
6.1样品的稀释
6.1.1固体和半固体样品:
称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:
10的样品匀液。
6.1.2液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
6.1.4按6.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。
6.1.5根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。
同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
6.1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±
1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
6.2培养
6.2.1待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±
1℃培养48h±
2h。
水产品30℃±
1℃培养72h±
3h。
6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,按6.2.1条件进行培养。
6.3菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
6.3.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;
若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
7结果与报告
7.1菌落总数的计算方法
7.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按下列公式计算:
式中:
N——样品中菌落数;
ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d——稀释因子(第一稀释度)。
示例:
稀释度
1:
100(第一稀释度)
1000(第二稀释度)
菌落数(CFU)
232,244
33,35
上述数据按7.2.2数字修约后,表示为25000或2.5×
104
7.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.2菌落总数的报告
7.2.1菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
7.2.2菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;
也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
7.2.4若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
附录A(规范性附录)
培养基和试剂
A.1平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基
A.1.1成分
胰蛋白胨5.0g
酵母浸膏2.5g
葡萄糖1.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000mL
pH7.0±
0.2
A.1.2制法
将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。
分装试管或锥形瓶,121℃高压灭菌15min。
A.2磷酸盐缓冲液
A.2.1成分
磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g
蒸馏水500mL
pH7.2
A.2.2制法
贮存液:
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液:
取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。
A.3无菌生理盐水
A.3.1成分
氯化钠8.5g
蒸馏水1000mL
A.3.2制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
乳酸菌的检测
1范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lacticacidbacteria)的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
2规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本
适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3术语和定义
3.1乳酸菌lacticacidbacteria
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。
本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、
双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus)。
4设备和材料
4.1恒温培养箱:
4.2冰箱:
4.3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
4.4天平:
感量0.1g。
4.5无菌试管:
18mm×
180mm、15mm×
100mm。
4.6无菌吸管:
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
4.7无菌锥形瓶:
500mL、250mL。
5培养基和试剂
5.1MRS(ManRogosaSharpe)培养基及莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS培养基:
见附录A
中A.1。
5.2MC培养基(ModifiedChalmers培养基):
5.30.5%蔗糖发酵管:
见附录A中A.3。
5.40.5%纤维二糖发酵管:
5.50.5%麦芽糖发酵管:
5.60.5%甘露醇发酵管:
5.70.5%水杨苷发酵管:
见附录A中A.3。
5.80.5%山梨醇发酵管:
5.90.5%乳糖发酵管:
5.10七叶苷发酵管:
见附录A中A.4。
5.11革兰氏染色液:
见附录A中A.5。
5.12莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):
化学纯。
6检验程序
乳酸菌检验程序见图1。
图1乳酸菌检验程序图
7操作步骤
7.1样品制备
7.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
7.1.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。
7.1.3固体和半固体食品:
以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内,
于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,制成1:
10样品匀液;
或置于225mL生理盐水的无菌均
质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:
7.1.4液体样品:
液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐
水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1:
7.2步骤
7.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:
7.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
7.2.3乳酸菌计数
7.2.3.1乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板,使用L形棒进行表面涂布。
36±
1℃℃,厌氧培养48h±
2h后计数平板上的所有菌落数。
从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
7.2.3.2双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS琼脂平板,使用灭菌L形棒进行表面涂布,每个稀释度作两个平板。
从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
7.2.3.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MC琼脂平板,使用L形棒进行表面涂布。
1℃,需氧培养48h±
2h后计数。
嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为:
菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2mm±
1mm,菌落背面为粉红色。
7.2.3.4乳杆菌计数
7.2.3.1项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2项双歧杆菌与7.2.3.3项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
7.3菌落计数
菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
7.3.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。
7.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;
若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
7.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
7.4结果的表述
7.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)中菌落总数结果。
7.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式
(1)计算:
…………………………………………
(1)
N——样品中菌落数;
∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d——稀释因子(第一稀释度)。
7.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
7.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.5菌落数的报告
7.5.1菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
7.5.2菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;
也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
7.5.3称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
8结果与报告
根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。
9乳酸菌的鉴定(可选做)
9.1纯培养
挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于MC琼脂平板,乳杆菌属接种于MRS琼脂平板,置
1℃厌氧培养48h。
9.2鉴定
9.2.1双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34的规定操作。
9.2.2涂片镜检:
乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。
无芽胞,革兰氏染色阳性。
嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。
9.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2。
附录A
(规范性附录)
培养基及试剂
A.1MRS培养基
A.1.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉粉5.0g
酵母粉4.0g
葡萄糖20.0g
吐温801.0mL
K2HPO4·
7H2O2.0g
醋酸钠·
3H2O5.0g
柠檬酸三铵2.0g
MgSO4·
7H2O0.2g
MnSO4·
4H2O0.05g
琼脂粉pH6.215.0g
A.1.2制法
将上述成分加入到1000mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后121℃高压灭菌15min~20min。
A.1.3莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS培养基
A.1.3.1莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液制备:
称取50mg莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)加入到50mL蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
A.1.3.2制法
将A.1.1成分加入到950mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后于121℃高压灭菌15min~20min。
临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48℃,用带有0.22μm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)的浓度为50μg/mL。
A.2MC培养基
A.2.1成分
大豆蛋白胨5.0g
牛肉粉3.0g
酵母粉3.0g
乳糖20.0g
碳酸钙10.0g
琼脂15.0g
1%中性红溶液
pH6.0
5.0mL
A.2.2制法
将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节pH,加入中性红溶液。
分装后121℃高压灭菌15
min~20min。
A.3乳酸杆菌糖发酵管
A.3.1基础成分
牛肉膏5.0g
蛋白胨5.0g
酵母浸膏5.0g
吐温800.5mL
琼脂1.5g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL
A.3.2制法
按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121℃高压灭菌15min~20min。
A.4七叶苷发酵管
A.4.1成分
磷酸氢二钾1.0g
七叶苷3.0g
柠檬酸铁0.5g
蒸馏水100mL
A.4.2制法
将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121℃高压灭菌15min~20min。
A.5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染
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