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我们利用基因工程技术构建了耐酸性淀粉酶和糖化酶的融合基因,并获得了多拷贝此融合基因的白曲霉菌TR12株并加强菌种筛选诱变育种工作。
在pH3.0的AP培养基或在pH4.0的酸性酒精废糟液中,培养液均表现出较高的耐酸性淀粉酶和糖化酶活性[8,9]。
用于固态制曲及酿酒发酵,原材料利用率、发酵速度及产酒率等都得到了较大幅度的提高[10]。
为了使耐酸性一淀粉酶的耐酸特性得到充分发挥,使其优越性能得到更加广泛的利用,同时也为了探讨通过一次发酵过程,制备具有两种较高酶活力的新型酶制剂。
目前,除开展大量常规诱变育种T作外,国外已初步搞清产α-淀粉酶的调控基因,探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。
将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株,使α-淀粉酶产量提高7~10倍,并已应用于食品和制酒工业,给选育高产α-淀粉酶菌株开创了新的途径[11]。
4、α-淀粉酶的特性
早在1967年,Jones和Varner就对小麦中α-淀粉酶的活性进行了研究[12]。
不同来源的α-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别,它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大,在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶,因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。
4.1底物特异性
α-淀粉酶和其它酶类一样,具有反应底物特异性,不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同,通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性,这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。
4.2最适pH和最适温度
通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。
真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内,如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3,碱性α-淀粉酶的最适pH在9~12。
另外,温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响,会改变其最适作用范围。
不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异,其中最适作用温度最低的只有25℃~30℃,而最高的能达到100℃~130℃。
另外,钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[13]。
4.3金属离子
α-淀粉酶是金属酶,很多金属离子,特别是重金属离子对其有抑制作用;
另外,巯基,N-溴琥珀酸亚胺,p-羟基汞苯甲酸,碘乙酸,BSA,EDTA和EGTA等对仅一淀粉酶也有抑制作用。
4.4电场强度
实验结果表明,不同强度电场导致酶活性增加的效应不同,并且呈非单调性变化。
我们认为,不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响,处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列,但可以改变酶蛋白的构象.姚占全等[14]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min,处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响。
第1天测定结果表明,电场对酶产生明显影响,而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同,在0.5~6.0kV/cm范围内,酶活性随场强增加呈非单调性变化,与对照组相比,变化幅度在5.5%~26.2%之间。
第1O天测定,酶活性变化幅度在0.2%~16.3%之间,表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。
5、α-淀粉酶的工业应用
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶,其最早的商业化应用在1984年,作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。
现在,α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业、纺织退浆和造纸工业。
5.1在焙烤工业中的应用
各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史,最近几十年α-淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多,如蛋白酶、脂肪酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等,但没有一种酶能取代α-淀粉酶在焙烤食品中的应用。
α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大,纹理疏松;
提高面团的发酵速度;
改善面包心的组织结构,增加内部组织的柔软度;
产生良好而稳定的面包外表色泽;
提高入炉的急胀性;
抗老化,改善面包心的弹性和口感;
延长面包心储存过程中的保鲜期。
面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬,易碎,风味变差,这些都是由于面包的陈化造成的,每年由于面包老化造成巨大的损失。
在使用α-淀粉酶时,对其加入量要求比较严格,稍微过量就会导致面包等焙烤食品粘度的增加。
因此,最近人们逐渐使用中温α-淀粉酶,由于其最适作用温度在50℃~70℃左右,所以其在淀粉糊化时具有活性,而在焙烤过程中则会逐渐失活,最终在焙烤完成时活性丧失。
而且,在加工过程中α-淀粉酶会水解淀粉生成聚合度在4~9的糊精,这些糊精也具有抗老化性。
但是,现在中温α-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取[15,16]。
5.2在啤酒酿造中的应用
啤洒是最早用酶的酿造产品之一,在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽,使辅料增加,成本降低,特别在麦芽糖化力低,辅助原料使用比例较大的场合,使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化,可以弥补麦芽酶系不足,增加可发酵糖含量,提高麦汁率,麦汁色泽降低,过滤速度加快,提高了浸出物得率,同时又缩短了整体糊化时间。
啤洒酿造中糊化时添加α-淀粉酶,在20世纪70年代主要用BF7658α-淀粉酶;
80年代用食品级枯草杆菌α-淀粉酶;
80年代末,我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温α-淀粉酶,可使副原料比例从原来的30%增加到40%以上,实现了无麦芽糊化,节粮、节能显著,使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高[17]。
5.3在酒精工业上的应用
在玉米为原料生产酒精中添加α-淀粉酶低温蒸煮的新工艺,每生产1t酒精可节煤224.42kg。
又可减少冷却用水,提高出酒率8.8%,酒精成品质量也有显著提高。
酒精生产应用耐高温α-淀粉酶。
采用中温95℃~105℃蒸煮,既可有效地杀死原料中带来的杂菌,降低入池酸度和染菌机率,又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏,形成焦糖或其它物质而损失,从而提高原料利用率[18]。
6、淀粉酶的分离提纯
目前酶的分离提纯技术日益成熟,酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:
即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。
以下是一些概括:
细胞破碎:
机械破碎法(捣碎、研磨、匀浆等)、物理破碎法(温度差、压力差、超声波等)(多用于微生物)、化学破碎法(使用甲苯、丙酮、氯仿等有机溶剂以及特里顿、吐温等表面活性剂)和酶促破碎法等等。
酶的提取:
使用盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂等
沉淀分离:
盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀。
离心分离:
离心机、离心方法、离心条件等。
过滤与膜分离:
非膜过滤(粗滤、部分微滤)、膜过滤(大部分微滤、反渗透、透析、电渗析)。
层析分离:
吸附、分配、离子交换、凝胶、亲和、层析聚焦等。
电泳分离:
纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦等。
萃取分离:
有机溶剂、双水相、超临界、反胶束等。
浓缩结晶:
盐析、有机溶剂、透析、等电点、温度差、金属离子等。
干燥成品:
真空、冷冻、喷雾、气流、吸附等。
[19]
7、淀粉酶的发展前景
7.1固定化淀粉酶
固定化酶在食品技术,生物技术,生物化学和分析化学中的技术日渐重要。
他们比游离酶的优点包括反应物分离容易,产品和反应介质易回收,重复或连续使用。
酶可以固定化到多种不同的载体。
通过吸附,离子和共价键结合等形式。
共价结合法是非常有效的保留酶活性的方法,可以实现固定化[20]。
随着科技的发展,淀粉酶的固定化使用越来越重要,也使大家在这方面的研究更加深入。
8、展望
综上所述,各种淀粉酶作为一种重要的工业用酶,已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中,且已经取得了很好的使用效果。
对缩短生产周期,提高产品得率和原料的利用率,提高产品质量和节约粮食资源,都有着极其重要的作用。
但由于不同来源淀粉酶的性质上的差异,导致了其应用受到一定的局限,如耐高温淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力,在低温和中温时其利用效率很低,从而限制了其应用范围。
另外,不同淀粉酶应用于食品中,其安全性有的尚未完全肯定。
因此,在以后的研究中,可以通过化学方法或生物方法对淀粉酶进行改性,扩展其使用的范围,提高使用效率。
无论如何,随着科技的发展、研究的深入,淀粉酶将会得到更加广泛的应用。
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247-251.
二、设计内容
1、设计的指导思想和主要设计内容
1.1设计的指导思想
⑴生物学原则:
根据不同微生物的营养和反应需求,设计培养基。
营养物质组成较丰富,浓度适当,满足菌体生长和合成产物的需求。
各种成分之间比例恰当,特别是有机氮和无机氮源,C/N比。
一定条件下,各种原材料之间不能产生化学反应。
具有适宜的pH和渗透压。
⑵工艺原则:
不影响通气,又不影响产物的分离精制和废物处理,过程容易控制。
保证产品的质量符合国家标准。
⑶低成本原则:
原材料要因地制宜,来源方便,丰富,质量稳定,质优价廉,成本低。
⑷高效经济原则:
生产安全,环境保护,高质量,最高得率,最小副产物。
⑸安全环保原则:
确保人身和设备的安全,减少三废排放,合理处理三废。
2、设计拟采取的工艺原理技术路线
2.1菌种的选育及制备
土壤是微生物聚集最丰富的场所,菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多,由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中,可以采集中性的土壤。
采集后可用平板划线法进行菌种分离。
由于野生型菌株生产性能较差,可进行诱变育种,利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异,再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体。
2.2培养基的配制
培养基的种类很多,可以根据组成、状态和用途等进行分类,按照用途可以分成孢子培养基,种子培养基和发酵培养基。
微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。
培养基的要求:
①营养不要太丰富;
②所用无机盐的浓度要适量;
③注意培养基的pH和湿度。
2.3种子扩大培养
本发酵属于一级种子罐扩大培养,二级发酵。
设计流程如下:
孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐
2.4空气灭菌
此课题为好氧发酵,以空气作为氧源。
根据国家药品质量管理规范的要求,生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。
获得无菌空气的方法有:
辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。
过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段,其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。
2.5发酵过程的工艺控制
(1)中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂,以满足微生物的代谢活动和产酶的需要。
(2)各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。
在发酵过程中,可通过添加适量的尿素或碳酸钙等来调节pH上升或下降。
(3)温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。
温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质,另一方面影响发酵液的物理性质。
不同的菌种有着不同的最适温度。
枯草杆菌发酵温度控制在35℃~37℃最适宜。
(4)淀粉酶发酵是需氧发酵,无论是基质的氧化,菌体的生长还是产物的合成均需大量的氧气。
若发酵液中氧气不足,可通过加大通气量,适当降低温度,提高罐压,补水,提高搅拌速度来控制。
(5)在工业发酵中,染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。
因此要严格无菌操作,种子灭菌要彻底,净化空气设备,操作要慎重,设备灭菌要彻底。
若在前期染菌,应重新灭菌;
中期染菌,应偏离杂菌生长条件;
后期染菌,可提前或及时放罐。
2.6下游加工
下游加工过程是生物工程的一个组成部分,是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得,以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。
预处理就是除去高价离子和蛋白质,对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸,草酸它与钙离子生成的草酸钙,还能促使蛋白质沉淀,加磷酸既能降低钙离子也能降低镁离子。
对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂,调节pH值或加热。
过滤:
采用鼓式真空过滤器,过滤前加去乳化剂并降温。
淀粉酶常用的提取方法有:
盐析法、乙醇淀粉吸附法和喷雾干燥法,这里用盐析法。
具体方法:
发酵液经热处理,冷却到40℃,加入硅藻土为助滤剂过滤。
滤饼加2.5倍水洗涤,洗液同发酵液合并后,在45℃真空浓缩数倍后,加(NH4)2SO4至40%饱和度。
盐析沉淀物加硅藻土后过滤,滤饼于40℃烘干磨粉即成粗酶制品。
由酶液到粉状制酶剂的收率为70%。
成品固体酶制剂的干燥方法有烘房、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥。
由于喷雾干燥生产能力大,维修保养简单,因此生产中常采用这种方法。
淀粉酶的纯化方法可采用凝胶过滤法,就是以特定的凝胶物质为分子筛装入层析柱,再通过分离溶液时大于凝胶孔径的分子会被排阻在胶粒外,因此它们将“绕道通过”;
小于该孔径的分子,由于可以自由出入胶粒内外,因此将沿着胶粒缝隙而直接流出。
通过一段程度的凝胶层析柱后,大小分子将依次先后流出。
3、淀粉酶的成产流程图
三、工作计划
序号
阶段及内容
起止日期
1
2
3
4
5
6
7
检索相关文献
确定设计目的,撰写开题报告
合理安排设计方案
对设计方案进行分析,校正
进行生产淀粉酶工艺设计
确定个方面数据,合理分析
攥写毕业论文,准备答辩,外文翻译贯穿整个过程
3月2日到3月13日
3月16日到3月20日
3月23日到3月27日
3月30日到4月3日
4月6日到5月8日
5月12日到5月22日
5月25日到6月10日
四、开题报告会提出的主要问题及建议
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