甘油解法制备鱼油甘油二酯的研究Word文件下载.docx
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1.1材料和仪器
粗鱼油:
厦门台迈生物科技有限公司提供;
油酸甘油单酯标准品、油酸甘油二酯标准品、油酸甘油三酯标准品:
美国SIGMA公司;
固定化脂肪酶LipozymeRMIM:
丹麦诺维信公司。
LCsolution15C高效液相色谱仪:
日本岛津公司;
RID检测器:
色谱柱SepaxBio-C18(4.6×
250mm,5μm);
GCMC-QP2010Plus气相质谱联用仪:
日本岛津公司。
1.2试验方法
1.2.1固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化鱼油甘油解反应
准确称取一定底物摩尔比的甘油和鱼油于100mL烧杯中,将烧杯置于恒温磁力搅拌器上预热到一定温度的水浴体系中,搅拌速度为150r/min,并加入一定量的固定化脂肪酶LipozymeRMIM,反应一段时间后,将反应产物在8000r/min下离心5min,除去固定化脂肪酶,取上层油样低温保存备用。
1.2.2高效液相色谱法检测
取30mg甘油二酯样品,用1mL乙腈:
异丙醇(60:
40,V/V)溶解,进行高效液相色谱检测其甘油二酯含量。
色谱条件:
流动相为乙腈:
异丙醇(V/V)为60:
40;
采用等浓度梯度洗脱,柱温40℃,流速0.8mL/min,洗脱时间为37min;
进样量20μL。
以样品峰的保留时间与油酸甘油酯标准品的保留时间定性,按峰面积归一法计算甘油二酯和甘油三酯的含量。
1.2.3气质联用测脂肪酸组成
样品甲酯化[18]:
取2滴样品于10mL试管,加0.5mol/L氢氧化钾-甲醇溶液1.0mL,摇匀,在60℃水浴中反应30min。
取出冷却至室温,加入3mL14%硫酸-甲醇溶液,摇匀,60℃水浴加热5min,冷却至室温,加入3mL正己烷提取上层溶液用于气相色谱分析。
气相色谱条件:
色谱柱为Rtx-5Ms,载气为高纯氦(He),柱箱温度100℃,进样温度260℃,柱流量2.05mL/min,分流比30:
1。
质谱条件:
电离方式EI,离子源温度230℃,接口温度250℃,质荷比范围:
45.00~400.00m/z,检测器电压:
1kV。
升温程序为:
120℃保持1min,以10℃/min升温到200℃,保持5min,再以10℃/min升温到240℃,保持5min。
2、结果与讨论
2.1单因素试验
2.1.1酶解温度对甘油二酯的影响
由于甘油很难溶解在油脂中,对合成甘油二酯的反应是不利的,为提高甘油与鱼油的互溶性,促进甘油解反应的进行,可以适当地提高反应温度。
但温度过高,则会影响酶的空间结构和构象,从而降低酶活力,所以试验需控制适宜的反应温度。
在底物摩尔比(甘油:
粗鱼油)为1:
1,加酶量为底物质量的1%,反应时间为10h的条件下,调节反应温度分别为30、40、50、60、70℃时进行试验,考察反应温度对甘油解反应中DAG含量及TAG含量的影响,试验结果如图1。
图1反应温度对DAG含量及TAG含量的影响
由图1可知,反应温度从30~50℃时,产物中DAG的含量逐渐增加,TAG含量减少,这是由于升高温度促进了底物之间的互溶,促进甘油解程度的增大,合成产物甘油二酯含量随温度的升高而增大。
从50~70℃,DAG的含量变化不大,从试验结果看出,当温度在70℃,脂肪酶的酶活力还没明显丧失,主要是由于在几乎没有水的反应体系中,由温度升高而引起的酶因受热失活在反应体系中被大大削弱了,这也是非水相酶催化反应的一个显著的优点[19]。
随着温度的升高,甘油在反应体系中的溶解度会有很大提高,但是酶长时间处于较高温度下,容易达到酶变性的活化能,酶活性下降。
综合考虑底物的互溶性以及酶的活性,故试验适宜反应温度选择为50℃。
2.1.2底物摩尔比对合成甘油二酯的影响
在脂肪酶催化合成反应中,甘油与鱼油的比例是决定甘油解产物组成的重要因素,底物摩尔比的改变会影响体系的稳定性及产物的扩散速率与含量。
在反应温度为40℃,加酶量为底物质量的1%,反应时间为10h的条件下,调节底物摩尔比(甘油:
粗鱼油)分别为1:
2、1:
1、2:
1、3:
1、4:
1时进行试验,考察底物摩尔比对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响,试验结果如图2所示。
图2底物摩尔比对DAG含量及TAG含量的影响
2~2:
1范围内,随着底物摩尔比的增加,DAG的含量明显增加。
说明当甘油的含量逐渐增加时,促进更多的鱼油甘油解,过量的甘油增加酯化程度,使得反应平衡向产物甘油二酯的方向移动。
当甘油和鱼油的摩尔比达到2:
1以后,继续增加甘油含量,DAG含量没有明显变化。
Tae-KilEom等[17]以研究发现,甘油和金枪鱼鱼油的最佳摩尔比为3:
1,这与本文研究结果较为接近。
在试验过程中,发现当底物摩尔比达到4:
1时,明显有甘油剩余,因此继续增加的甘油没有参与反应,故最适的底物摩尔比(甘油:
粗鱼油)选择2:
2.1.3加酶量对合成甘油二酯的影响
在无溶剂体系中,脂肪酶的添加量是影响DAG合成率的一个因素。
在反应温度为40℃,底物摩尔比(甘油:
1,反应时间为10h的条件下,调节固定化脂肪酶LipozymeRMIM的添加量分别为底物总质量的0.1%、0.5%、1%、2%、3%进行试验,考察加酶量对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响,试验结果如图3所示。
图3加酶量对DAG含量及TAG含量的影响
当加酶量从0.1%加到2%时,TAG质量分数从30.68%下降到了5%。
当加酶量超过2%之后,DAG和TAG含量变化不明显。
加酶量在0.1%~0.5%范围内,甘油二酯的含量明显增加,这是因为随着脂肪酶用量的增加,甘油解的速度加快,因此甘油二酯含量增加。
当加酶量超过1%后,产物中甘油二酯的含量却不断下降,Kristensen等[20]研究发现当加酶量过多时,DAG的含量反而下降,这是因为过量的酶的降低了甘油解的程度,过量的酶可能会导致无规律的混合,从而增加对传质的限制。
Zhang-QunDuan等[21]认为过量的酶导致生物催化剂结块和可能存在扩散问题,因此酶过量会使得DAG含量下降。
当加酶量为2%时,TAG含量最少,但此时的DAG含量却不是很高,综合考虑DAG含量以及经济问题,最适加酶量选择0.5%。
2.1.4酶解时间对合成甘油二酯的影响
当体系反应时间不同时,底物的甘油解反应程度也不相同,因此反应时间也是影响DAG合成率的因素之一。
1,加酶量为底物质量的1%,调节反应时间分别为2、4、6、8、10、12h进行试验,考察酶解时间对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响,试验结果如图4所示。
图4反应时间对DAG含量及TAG含量的影响
反应时间在2~6h范围内,DAG的含量明显增加,TAG含量减少,DAG质量分数达到40.92%。
当反应时间超过8h后,整个反应趋于平衡,TAG的和DAG含量都没有明显变化。
这是由于甘油解反应遵循化学平衡反应的规律,反应进行一定时间后将达到平衡,在反应体系达到平衡之后即使再增加反应时间,转化率也不会增加。
当反应时间为6h时,虽然DAG质量分数比较高,但此时TAG的质量分数比较高,含有16.06%;
10h时TAG质量分数最少,仅有8.02%。
但是反应时间越长,试验的能耗越大,故在合理范围内应尽量缩短反应时间。
因此综合考虑DAG含量以及TAG的含量问题,故最适反应时间选择8h。
2.2响应面设计方案及结果
根据单因素试验的试验结果,选取反应时间、反应温度、底物摩尔比(甘油:
鱼油)、加酶量4个影响因素为自变量,以反应产物中DAG的含量作为响应值,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,运用DesignExpert8.0进行响应面设计。
+1、0、-1分别代表四因素的高、中、低水平,设计响应面因子及水平如表1所示,试验设计及试验结果如表2所示。
表1响应面因子和水平
水平
A反应温度
/℃
B反应时间
/h
C底物摩尔比
/(mol/mol)
D酶添加量
/%
-1
45
6
1.5
0.3
50
8
2.0
0.5
1
55
10
2.5
0.7
表2响应面设计及结果
试验号
A
B
C
D
DAG质量分数/%
45.00
8.00
2.00
0.30
38.08
2
55.00
2.50
0.50
40.44
3
1.50
35.13
4
39.37
5
38.89
50.00
44.92
7
10.00
38.67
6.00
46.35
9
44.04
41.04
11
40.82
12
39.92
13
0.70
45.32
14
46.12
15
40.43
16
42.20
17
44.14
18
39.96
19
38.30
20
40.94
21
38.09
22
42.00
23
44.02
24
44.81
25
45.66
26
39.70
27
37.06
对表2的试验数据进行回归分析,得DAG含量的二次回归方程为:
Y(%)=45.13+0.39A-1.13B+1.43C+2.47D-0.79AB-0.94AC-0.53AD-2.45BC-1.98BD-0.18CD-2.42A2-1.35B2-3.22C2-1.52D2
对回归方程进行方差分析,结果见表3。
从表3可以看出,模型R2=0.9363,校正R2Adj=0.8619,P<0.0001,表明模型达到高度显著水平,且失拟项P=0.1301>0.05,即失拟项不显著,说明这个回归模型拟合的很好。
因此,此模型建立成功,适合用于甘油解法合成鱼油甘油二酯的条件优化。
其中B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05,对甘油二酯的影响是显著的,按照模型的线性数值大小,可以得出对甘油二酯含量影响大小依次为:
D>
C>
B>
A,即加酶量>
底物摩尔比>
反应时间>
温度。
响应面试验结果表明,底物摩尔比和酶添加量对DAG的产率影响为极度显著,反应时间和底物摩尔比、反应时间和加酶量比的交互作用对DAG产率的影响较大。
表3回归模型方差分析表
来源
总平方和
自由度
平均平方
F值
P>
F
模型
228.34
16.31
12.59
<
0.0001
显著
A-温度
1.86
1.44
0.2534
B-时间
15.19
11.72
0.0050
C-摩尔比
24.62
19.01
0.0009
D-加酶量
73.41
56.66
AB
2.53
1.95
0.1877
AC
3.53
2.73
0.1245
AD
1.11
0.86
0.3723
BC
24.06
18.57
0.0010
BD
15.64
12.07
0.0046
CD
0.13
0.10
0.7572
A2
31.17
0.0004
B2
9.77
7.54
0.0177
C2
55.30
42.68
D2
12.26
9.46
0.0096
残差
15.55
1.30
失拟项
15.12
1.51
7.08
0.1301
不显著
纯误差
0.43
0.21
总和
243.89
R2=0.9363
R2Adj=0.8619
2.3最佳条件预测与验证
根据Box–Behnken方法分析,得到甘油二酯含量最佳反应条件为:
反应温度50.13℃、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比(甘油:
鱼油)为2.29:
1、时间6.00h,此时DAG质量分数预测值为48.90%。
将其最佳反应条件调整为:
反应温度50℃、脂肪酶添加量为0.7%、底物摩尔比(甘油:
鱼油)2.3:
1、时间6h,在此条件下进行三次平行试验,得到平均值为48.07%,与理论值接近。
说明采用响应面优化得到的DAG含量数据可靠,具有预测使用价值。
2.4甘油酯脂肪酸分析
粗鱼油以及合成后DAG的脂肪酸如表4所示。
从表4可看出,鱼油的脂肪酸主要组分为棕榈酸、油酸和棕榈油酸。
从粗鱼油与合成的DAG的脂肪酸组成及含量可以看出,二者的种类及含量几乎没有变化,说明通过本试验制备甘油二酯没有破坏其中脂肪酸的组成,合成的鱼油DAG能够保持鱼油原有的脂肪酸组成,这对鱼油DAG的营养价值有重要的意义。
表4粗鱼油及甘油二酯的脂肪酸组成
序号
脂肪酸名称
粗鱼油中脂肪酸百分含量/%
甘油二酯中脂肪酸百分含量/%
月桂酸C12:
0.14
0.15
肉豆蔻酸C14:
7.52
7.64
十五烷酸C15:
0.48
0.49
棕榈酸C16:
22.07
22.73
棕榈油酸C16:
18.23
17.99
十七酸C17:
0.16
硬脂酸C18:
3.44
3.42
油酸C18:
25.09
24.90
亚油酸C18:
2.78
2.69
二十碳烯酸C20:
8.68
8.56
二十碳四烯酸C20:
1.19
1.16
EPAC20:
3.97
3.93
DHAC22:
5.73
5.69
3、结论
本研究在无溶剂体系中,采用甘油解法,用固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化鱼油制备甘油二酯,所得产物采用高效液相分析其甘油二酯含量。
通过对影响DAG产率反应温度、底物摩尔比、酶添加量、反应时间的单因素试验考察,结合Box–Behnken方法进行响应面试验设计,确立了甘油解法制备鱼油甘油二酯的最佳工艺条件:
反应温度50℃、时间6h、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比2.3:
1,甘油二酯质量分数为48.27%。
通过对比粗鱼油与甘油二酯的脂肪酸含量,发现脂肪酸含量及组成几乎没有变化,因此鱼油甘油二酯既可以较好的保持鱼油脂肪酸的组成优势,又可同时具有DAG的特殊营养学特性,为进一步研究鱼油甘油二酯提供理论依据,同时也可提供鱼油的附加值。
参考文献
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[2]ZhengM,HuangQ,HuangF,etal.ProductionofNovel“FunctionalOil”RichinDiglyceridesandPhytosterolEsterswith“One-Pot”EnzymaticTransesterification[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry.2014,62(22):
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[3]MoritaO,SoniMG.Safetyassessmentofdiacylglyceroloilasanedibleoil:
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