生物工程概论课件.ppt
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生物工程概论,动物科技学院,第一章绪论,第一节生物工程的概述,1.1生物工程的产生及定义1.2生物工程的种类,1.1生物工程的产生及定义,生物工程概念的提出1917年匈牙利工程师提出:
用甜菜作为饲料进行大规模养猪,及利用生物将原料转化成为产品.,19世纪:
人类有意识的利用酵母进行大规模发酵生产:
酒精、面包酵母、柠檬酸,1928年发现青霉素,同时以获取细菌的次级代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业成为当时生物技术的支柱产业。
20世纪50年代,氨基酸发酵工业成为生物工程的一个新成员20世纪60年代酶制剂工业的出现,20世纪末、21世纪初,人类基因组测序酵母基因组测序、水稻基因组测序先后基本或全部完成,使生物技术发生了巨大的革命,逐步形成了以基因工程为核心的现代生物技术,生物工程定义的充实,1917:
利用生物将原材料转化为产品1982:
应用自然科学及工程学的原理,依靠微生物、动物、植物作为反应器,将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术,生物工程的定义:
人们以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理,按照预先的设计改造生物体或加工原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的,即现代生物工程技术。
1.2生物工程的种类,基因工程细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程应用:
农业、环境、食品、医药等多个方面,基因工程,也叫基因操作、遗传工程或重组DNA技术,是20世纪70年代以后兴起的一门新技术。
基因工程(geneengineering)是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的技术。
即按照人们的需要,用类似工程设计的方法将不同来源的基因(DNA分子)在体外构建成杂种DNA分子,然后导入受体细胞,并在受体细胞内复制、转录和表达的操作,也称DNA重组技术。
因此,由该技术构建的且具有新遗传性状的生物称为基因工程生物或转基因生物。
细胞工程,细胞工程(cellengineering)是指以细胞为基本单位,在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而达到改良生物品种和创造新品种的目的,加速繁育动植物个体,或获得某种有用物质的技术。
细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。
发酵工程,发酵工程(fermentationengineering)是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能,通过现代工程技术手段(主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化)生产各种特定的有用物质;或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。
由于发酵多与微生物密切联系在一起,所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。
酶工程,利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能以及对酶进行的修饰改造,并借助于生物反应器生产人类所需产品的一项技术。
主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。
蛋白质工程,蛋白质工程(proteinengineering)这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的,它是指在基因工程的基础上,结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手段,对蛋白质进行修饰、改造、拼接,以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。
现代生物技术的发展现代生物技术时期是以分子生物学的理论为先导,以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。
1944年美国微生物学家Avery等用实验证明了DNA是遗传信息的携带者。
1953年美国学者Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构,1958年Crick又阐明了DNA的半保留复制模式,从而奠定了现代分子生物学的基础。
1961年Nirenberg,1965年Holley,1967年Khorana分别对20种常见氨基酸以及起始和终止密码完成了破译。
1972年Berg创建了DNA体外重组技术,这标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。
生物工程发展的趋势,目前三个平台:
DNA重组、细胞培养和DNA芯片未来将会形成的几个新的平台1.基因组平台2.生物芯片3.干细胞生物学4.生物信息学5.神经科学,第二章基因工程,基因工程基础,内容,基因工程研究,基因工程的应用,第一节基因工程基础,基因工程的定义、研究内容,基因工程的工具酶,基因工程的载体,基因工程中的一些主要分子生物学方法,基因工程geneengineering,运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA,再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达,从而改变生物遗传性以创造生物新种质,或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。
基因工程的基本过程就是利用重组DNA(recombinantDNA)技术,在体外通过人工“剪切(cut)”和“拼接(splice)”等方法,对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞内进行增殖,并使重组基因在受体内表达,产生出人类需要的基因。
基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质(基因)分离出来,在体外进行剪切、拼接、重组,形成基因重组体,然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达,最终获得人们所需要的基因产物。
基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,基因工程研究的理论依据,不同的基因有相同的物质基础,基因是可切割的,基因是可转移的,多肽与基因之间存在对应关系,遗传密码是通用的,基因工程技术路线,1、DNA片段的取得(目的基因的分离和制备),2、DNA片段和载体的连接重组体DNA,3、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库,4、选择基因(目的基因),5、目的基因表达,切接转选表达,1.1基因工程的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,DNA连接酶,基因的剪刀,基因的针线,一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。
restrictionendonuclease这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。
限制性核酸内切酶,根据酶的功能、大小和反应条件,及切割的特点,可以将限制性内切酶分为三类:
型酶、型酶、型酶型酶不适合做基因工程的工具酶型酶在基因工程中也不常用型酶是基因工程理想的工具酶,限制性核酸内切酶,型限制性核酸内切酶的基本特性,1、识别序列和切割位点,2、切割方式,3、同尾酶和同裂酶,4、限制性片段长度:
经限制性核酸内切酶切割后产生的DNA片段。
切割频率:
某限制酶在该DNA切割位点出现频率,型限制性核酸内切酶的基本特性,1、识别序列,可识别长度为4-7bp的双链DNA特定序列,该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性。
1、切割位点,切割位点与其识别序列一致,在其识别序列内切割DNA。
型限制性核酸内切酶的基本特性,2、切割方式,DNA的限制性酶切,型限制性核酸内切酶的基本特性,指来源不同、识别序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
同裂酶指来源不同、而识别序列和切割方式均相同的核酸内切酶。
3、同尾酶和同裂酶,DNA连接酶,能够将两端DNA拼接起来的酶类原核生物主要有两种类型的DNA连接酶:
EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
最常见的是T4噬菌体DNA连接酶,DNA连接酶能够催化DNA链上彼此相邻的3-羟基(OH)和5-磷酸基团(-P),形成磷酸二酯键。
DNA连接酶,DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段DNA连接酶的作用是将双螺旋DNA分子的某一条链上两个相邻核苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封闭起来,即催化3-OH和5-p之间形成磷酸二酯键,从而将具黏性末端的双链DNA、平末端双链DNA以及带缺口的双链DNA连接起来。
原核生物主要有两种类型的DNA连接酶,EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶催化反应能量来源不同T4DNA连接酶用ATP,而EcoliDNA连接酶则用NAD催化平末端连接的能力不同只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的双螺旋的DNA片段,
(一)常用的DNA聚合酶:
大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶TaqDNA聚合酶,催化DNA体外合成反应,DNA聚合酶,DNA聚合酶I(DNasel)是一种单链多肽蛋白质,具有三种不同的酶催活性,即53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性。
主要用途是通过DNA缺口平移,制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针(图22),Klenow酶的主要用途,修补经限制性内切酶消化或其他方法所形成的5或3突出末端,制备平末端。
对具有3隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记。
cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。
DNA序列测定。
T4DNA聚合酶,这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯化而来,具有两种酶催活性,即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。
主要用途,可将任何形式的双链DNA制备成平末端的双链DNA。
外切酶的活性比Klenow酶强200倍,并且在高浓度的dNTP存在时,降解作用即会停止进行双链DNA的3末端标记。
T7DNA聚合酶,具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性主要用途:
用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应;如同DNA聚合酶一样,可通过单纯的延伸或取代合成的途径,标记DNA的3末端,也可用来将双链DNA的5或3突出端转变成平末端的结构。
修饰的T7DNA聚合酶,对天然的T7DNA聚合酶进行修饰,使之完全失去35的核酸外切酶活性修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单链模板上的聚合作用的速率增加了39倍测序时常用此酶,故亦称测序酶,TaqDNA聚合酶,最适的活性温度是72,连续保温30min仍具有相当的活性在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中,能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板,按53的方向合成新生的互补链DNA。
(二)分子克隆中常用的其他工具酶,甲基化酶末端转移酶碱性磷酸酶逆转录酶S1核酸酶Bal31植酸酶,1.2基因工程的载体,载体的功能:
运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,Vector,本质是DNA携带外源基因进入到受体细胞的运载工具,基因克隆载体具备条件,在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA片段组入的克隆位点,并且这样的克隆位点应尽可能的多。
克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细胞,或停留在细胞质中进行自我复制;或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中,随这些DNA同步复制。
具有能够直接观察的表型特征,基因克隆载体具备条件,克隆载体必须是安全的。
易于从宿主细胞中分离,并进行纯化。
根据导入的受体生物。
可以分为:
大肠杆菌载体植物载体酵母载体动物载体,基因克隆载体分类,大肠杆菌载体,质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体,将外源DNA导入原核生物细胞,1、质粒载体,质粒(plasmid)是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质,一般为双链的共价闭合环状DNA。
BR322质粒载体:
“P”表示是一种质粒;“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。
质粒载体的条件,一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件。
1具有复制起点2具有抗菌素抗性基因3具有若干限制酶单一识别位点4具有较小的分子量和较高的拷贝数,BR322质粒载体的优点:
1、具有较小的分子量;它的分子量为4363bp。
克隆载体的分子量大小不要超过10kb。
2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。
其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部,2种识别位点在于这个基因的启动区内,所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活;另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点,3、具有
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