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实验总结等。
为满足课程教学的需要,经反复修改,特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军,郭振飞,方颖、刘娥娥老师参加编写,在此一并表示感谢!
本实验指导为试用第五版,试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改,敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
编者
2006年11月
实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选
一、目的
学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理
产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中,从而水解培养基中的淀粉,由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉(本实验为RBV-淀粉,呈鲜艳的紫红色),当其被淀粉酶作用后便形成可溶,且较易扩散的小分水解物,从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。
本方法有快速、简单易行等优点。
图1产淀粉酶菌落形成的透明圈
三、材料、试剂和仪器
1、菌的来源
取不同地点的表层土壤。
2、试剂:
RBV-Starch(Sigma),NaNO3,K2HPO4,MgSO4,KCl,2mol/LNaOH无菌水和琼脂粉等。
3、器皿
250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200μL移液枪、200μL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。
4、仪器设备
高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。
四、实验操作步骤
1、器皿的消毒:
培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好,在121℃下灭菌20min,取出备用。
2、培养基的配制与灭菌
培养基的组成为:
RBV-淀粉(1.2%,w/v),NaNO3(0.2%,w/v),K2HPO4(0.2%,w/v),MgSO4·
7H2O(0.1%,w/v),KCl(0.1%,w/v),琼脂(2%,w/v),调PH至6.0左右。
在三角瓶中,121℃灭菌20min,将灭菌后的培养基倒入培养皿,每皿大约15mL,静置凝固备用。
(倒平板之前务必将培养基摇晃均匀,以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀,影响菌落的观察。
)
3、土样的采集及稀释
于校园等不同地点采集土壤样品;
取样时,用取样器向下打取1cm左右深度的土样,将从各个地点取得的土样混合;
取样点最好选择有机质丰富的地方。
4、富集
称取5.0g混合土样和0.5g的淀粉混合,并加入适量的蒸馏水使其湿润,置于培养皿中富集培养24h。
5、菌种的初筛
称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中,在超净工作台内(亦可使用酒精灯,直接在实验台上完成),加入无菌水至5mL,振荡后静置,待土壤颗粒沉降后,取上层液1mL转移至另一刻度试管中,加入9mL无菌水,摇匀;
从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管,加入9mL无菌水,摇匀;
再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管,加入9mL无菌水,摇匀。
如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。
用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50μL,加入至已凝固的培养基表面,用涂抹棒涂布均匀。
将涂过样的培养皿倒置放置,于30℃培养箱里培养,观察菌落透明圈的出现情况。
(一般30h后即可出现一些透明圈)。
6、菌株的纯化
于超净工作台内(亦可使用酒精灯,直接在实验台上完成)用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离,培养一定时间,进一步分离能形成透明圈的单菌落。
并在斜面培养基中保存。
图2平板划线分离法示意图
五、结果处理与分析
1、菌落产生透明水解圈的观察
用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小,求平均值,并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。
表1不同菌落产淀粉酶能力的比较
菌落编号
菌落直径(mm)
透明圈直径(mm)
透明圈直径/菌落直径
菌落形态特征
2、侯选菌落的形态观察:
观察并描述分离所得菌株的菌落形态,以大致了解产酶菌株属于那一类菌。
3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落如果不是请分析原因。
六、注意事项
1、进行无菌操作前,将接种所需用具放于台面铁架上,对超净工作台即周围环境进行75%酒精喷雾,使灰尘沉降,打开紫外灯照射灭菌30min,操作前,用75%酒精喷手杀菌。
(在本实验中省去此步)。
2、操作应尽量靠里,在酒精灯的火焰旁工作。
3、实验过程中避免说话、走动。
4、每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼烧灭菌,冷却后再涂下一块板。
实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离
一、目的
学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基本原理和方法。
二、原理
许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性(分子间通过某些次级键结合,如范德华力,疏水力,氢键等,在一定条件下又可解离)。
如:
酶和底物(包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物)的结合,特异性的抗体一抗原(包括病毒、细胞)、激素与其受体、载体蛋白的结合,基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合,植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。
均属于专一性而可逆的结合,这种分子之间的结合能力叫做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。
它具有分离快速,纯化效率高。
特别是对于那些含量少,杂质多,采用常规方法难于分离的生物活性分子,显示了独特的优越性。
因此,亲和层析技术已成为纯化生物分子,特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质,其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离,尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。
磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。
溶菌酶(Lysozyme,EC.)广泛地存在于动物、植物和微生物中,其中鸡蛋清中的含量较为丰富。
鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6KD,由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白,含有4个S-S键,在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。
溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键,几丁质(又称甲壳素)则是这类细胞壁多糖的类似物,因此可利用溶菌酶与甲壳素间的特异结合来分离纯化溶菌酶。
三、材料、试剂及仪器
1、材料
●新鲜鸡蛋清:
取自市售的鸡蛋。
●亲和层析介质:
几丁质磁性凝胶介质(自制)。
●溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)(Sigma公司)
2、试剂
●0.15NHAc:
吸取18mL冰乙酸,定容至1000mL。
●10%的HAc:
吸取100mL冰乙酸,用蒸馏水定容至1000mL。
●0.2mol/LNaHCO3溶液:
称取16.8gNaHCO3,溶解,定容到1000mL。
●5mmol/LNaHCO3溶液(含0.2mol/LNaCl):
先将0.2mol/LNaHCO3稀释40倍,再于每升溶液中加入NaCl11.688g。
●5mmol/LNaHCO3溶液(不含NaCl):
将0.2mol/LNaHCO3稀释40倍。
●10mmol/LNaHCO3溶液:
将0.2mol/LNaHCO3稀释20倍。
●1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.2):
Na2HPO3·
12H2O4.7752g,KH2PO47.2576g,溶解,定容至1000mL。
●考马斯亮蓝G-250:
称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL90%乙醇,加入85%磷酸100mL,用蒸馏水定容至1000mL,过滤。
●2mol/LNaOH:
称取80g的NaOH定容至1000mL。
●0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNH4Ac):
称取32.78g的Na2HPO3·
12H2O,1.33g的NaH2PO4·
2H2O,38.54g的NH4Ac溶解后,定容至1000mL.
3、仪器
分部收集器、分光光度计、恒温水浴器、恒流泵、电子天平、强力电动搅拌器、抽滤装置。
四、操作步骤
(一)、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离
1.亲和层析介质的再生和平衡:
用3-4个床体积的5mmol/LNaHCO3(含NaCl)溶液淋洗亲和层析介质即可。
(若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染,可用0.5mlo/L的NaOH淋洗亲和层析进行在位清洗)
2.蛋清提取液的制备:
取一个新鲜鸡蛋的蛋清,用5mmol/LNaHCO3(不含NaCl)液搅匀并稀释至400mL,双层尼龙布过滤,取滤液。
(测定酶液总体积,并留1.0mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定)。
3.酸和热变性:
用10%的HAc将稀释后蛋清的pH值调至4.5,60℃水浴15分钟,双层尼龙布过滤,取滤液,用2mol/L的NaOH将上清的pH值调回至7.0(边缓慢加入NaOH边搅拌,以免局部溶液pH值过高和将pH值调过头),(测定酶液总体积,并留1.0mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定)。
4.开放吸附:
向步骤3的上清液中加入上述平衡好的磁性凝胶介质,于烧杯中用玻棒缓慢搅拌30min(见图1-1)。
(尽量缓慢地搅拌,以免破碎凝胶颗粒)。
在此步骤中溶菌酶被亲和吸附到凝胶介质上。
5.介质的磁性回收及洗涤:
用带环型条纹塑料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集亲和介质,此时介质被吸附于塑料外套的表面,取出塑料外套中的磁铁将吸附于塑料外套的表面的介质悬浮于10mmol/LNaHCO3溶液中,缓慢搅拌洗涤介质,磁性回收,如此洗涤介质2次(见图1–2,3)。
将洗涤后的介质装柱(测柱径及层析床的高度),再用pH7.8含0.5mol/LNH4Ac的0.1mol/L磷酸钠盐缓冲液(以下称溶液B)洗涤至流出液的A280<
0.05时,再用10mmol/LNaHCO3溶液20mL洗涤以替换柱子中的溶液B,以便下一步的洗脱操作。
123
图1鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和吸附分离
1溶菌酶的开放吸附;
2亲和介质的磁性收集;
3介质的洗涤
6.洗脱:
用0.15NHAc溶液进行洗脱,流速控制在30ml/h左右,分部收集(4mL/管),分别测定A280nm(其可快速地监控蛋白的洗脱情况)和酶活性,收集活性部分即为纯化酶,4℃下保存备用。
(测定酶液总体积)。
因本步骤所得酶液的活性很高,故应取部分酶液(如0.2mL)稀释10倍后再用于酶活性测定,而用于蛋白含量测定时则不必稀释)。
7.用离心管保留粗提液及酸热变性后的酶液,用刻度试管保留亲和层析后的酶液,放置在4℃,以备实验三和四使用。
(二)、测定方法
1.溶菌酶活性的测定
原理:
由于溶菌酶能水解溶壁微球菌,使得底物悬浮液的浊度(可用450nm波长下的吸光度来衡量)下降,故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。
具体方法为:
将溶壁微球菌研磨并溶于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.2)中,使其A450nm在0.6-0.9间。
吸取上述底物悬浮液2.0mL于玻璃比色杯,然后加入0.05mL酶液,用移液枪搅动迅速混匀,启动反应,测定1min内A450nm的变化(用0.1mol/L磷酸缓冲液调零,当盖上分光光度计2-3秒钟后开始用秒表计时并读数),每15s记录一次读数。
酶活力的计算:
首先要自定义酶活性单位(U)。
定义在当前测定条件下,使测定体系在450nm波长下吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
酶液活力(U/mL)=
2.蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量。
取50uL的样品液加入2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,放置5min后,在595nm波长下测定吸光度,并根据标准曲线计算出蛋白含量。
(由标准曲线求得的回归方程为:
酶样蛋白含量:
b(mg/mL)=1.674×
A595nm-0.0354)
五、结果处理与分析
1、
绘制亲和层析洗脱曲线。
(参考下图格式绘制)
图2鸡蛋清溶菌酶的亲和层析(2.0×
15cm)
流速:
60mL/h;
4.0mL/管
2、制作纯化表。
对每个纯化步骤中的酶样测定以下3个指标:
●单位体积酶样的活性:
a(U/mL)=△A450/(1.0min×
0.01×
0.05mL),即酶液活力。
●酶样的蛋白含量:
b(mg/mL)、
●酶样总体积:
c(mL)。
由此即可制作如下纯化表:
表1鸡蛋清溶菌酶纯化表
纯化步骤
总体积(mL)
总蛋白(mg)
总活性(U)
比活性
(U/mg蛋白)
回收率
(%)
纯化倍数
(×
浓缩倍数(×
粗提液
C1
b1×
a1×
a1/b1
100
1
酸、热变性
C2
b2×
a2×
a2/b2
a2/a1
亲和层析
C3
b3×
a3×
a3/b3
a3/a1
3、常见的酶活性表示方法有那些(如:
U/mL酶液;
U/mgprotein;
U/g干重或鲜重;
U/g酶粉等)它们各有什么含义,适用哪些场合
4、与一般介质相比磁性亲和介质有何优缺点
5、层析操作中如何更换缓冲液
6、如何保存介质
1、搅拌开放吸附时,搅拌的速度不要太快,以免破坏介质,搅拌速度以能使介质悬浮即可。
2、装好层析柱后,应在介质的面上铺一张圆形的小滤纸片,以免在柱层析过程中介质被液滴冲起。
实验三、纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析
了解酶(蛋白质)纯度鉴定的常用手段。
掌握用SDS-PAGE法进行蛋白纯度鉴定。
蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法,如:
电泳、HPLC等。
其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等。
纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时,都将以单一的速度泳动,它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。
HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定,纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。
三、材料、试剂
1.材料:
实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。
2.试剂:
溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)(Sigma公司)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、甘氨酸、琼脂、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、巯基乙醇、溴酚兰、甘油、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰乙酸等。
低分子量标准蛋白(上海生化研究所),(已处理好不必再加样品裂解液进行处理!
!
电泳试剂配制:
(1)30%凝胶贮液:
取30g丙烯酰胺(Acr),0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)加水定容至100mL,过滤后置棕色瓶中,于4℃保存备用。
(2)电极缓冲液:
Tris3.03g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g,溶解并定容至1000mL(pH值约8.3)。
(3)1%琼脂糖溶液:
1g琼脂+100mL电极缓冲液加热溶解。
(4)样品裂解液(2×
SDS加样缓冲液):
10%SDS:
1.00mL巯基乙醇:
0.1mL
浓缩胶buffer:
0.5mL水:
0.15mL共:
2.5mL
甘油:
0.5mL2%溴酚兰:
0.25mL
(5)染色液:
称考马斯亮蓝R-2500.5g,甲醇225mL,冰乙酸50mL,定容至500mL。
(6)脱色液:
取冰乙酸75mL,甲醇50mL,定容至1000mL。
(7)分离胶缓冲液:
取18.15gTris溶解后,加6mol/LHCl溶液4mL,调pH值至8.8,定容至100mL。
(8)浓缩胶缓冲液:
取6.0gTris溶解后,加6mol/LHCl溶液8mL,调pH值至6.8,定容至100mL。
(9)10%SDS:
取10g溶解后,定容到100mL。
(10)1%过硫酸铵:
取0.1g溶解后,定容到10mL。
(11)TEMED:
分装。
其它试剂:
●1mol/LNaOH:
称取20g的NaOH定容至500mL。
1.封琼脂糖:
取加热溶解的1%琼脂糖溶液,用滴管加入两玻璃板底部的凹槽中,冷却凝固以封住两玻板间底部的缝隙。
2.分离胶制备:
加分离胶至玻板顶部3cm处,立即覆盖水层,静置至胶与水层形成清晰的界面。
3.浓缩胶的制备:
倒去水层,用滤纸吸干,加浓缩胶,插入梳子,静置聚合。
注意:
每一次吸胶后,立即用蒸馏水洗净滴管及微量进样器,以免堵塞!
附:
胶溶液配方:
分离胶12.5%15%
30%凝胶贮液3.15mL3.75mL
水2.1mL1.60mL
分离胶bufferpH8.81.90mL1.85mL共7.5ml
10%SDS0.1mL0.10mL
1%过硫酸铵0.25mL0.25mL
TEMED5μL5μL(最后加入以启动反应)
浓缩胶
30%凝胶贮液0.7mL
水2.85mL
10%SDS0.1mL
浓缩胶buffer1.2mL共5mL
1%过硫酸铵0.25mL
TEMED10μL(最后加入以启动反应)
4.样品的浓缩与脱盐:
因实验2亲和层析所得的纯化溶菌酶的蛋白浓度太低不利于电泳后染色,故先要对其进行如下浓缩:
(注:
本实验中的其它样品不必浓缩)
1)取amL样品(在本实验中用1.0mL纯化的鸡蛋清溶菌酶),缓慢加入4amL-20oC预冷的丙酮(边加边混匀),然后将其在-20oC静置2h以上。
离心(10000rpm,10min)后,弃上清(用吸管轻轻吸取上清),并将试管口倒扣于吸水纸上约半分钟以沥干溶液,沉淀于空气中干燥后备用。
2)取适量样品裂解液(本实验中约用60μL)溶解沉淀----用移液枪反复吸冲壁——然后吸取至1.5mL离心管中——沸水浴加热3-5min——离心备用(12000rpm,5min)。
3)本实验中的其它样品(粗酶、酸和热变性酶)不必浓缩,按1:
1加入样品裂解液(100μL酶液加100μL样品裂解液),100℃加热处理5min离心后备用;
标准分子量蛋白100℃加热处理3-5min后,即可使用。
5.上样
向电泳槽中加上电极缓冲液,上接负极(黑),下接正极(红)。
用微量进样器在加样孔中点样。
(上样量在15-25μL间比较合适)
6.电泳:
开始时用8mA电流,当溴酚蓝迁移至分离胶处后,改用10mA电流。
7.染色、脱色:
取出凝胶平板(从尾部撬出!
以免弄烂玻璃板)切去浓缩胶或琼脂糖部分,于蒸馏水中漂洗3min,如此重复2次,浸于染色液中,不断振荡1-2hr,脱色,半小时换一次脱色液。
五、电泳结果分析
1.根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。
2.根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率,计算目的蛋白的分子量(以lgM对迁移率R作图,其中M为蛋白质分子量)。
123
图1鸡蛋清溶菌酶的SDS-PAGE图谱
1.亲和层析后的鸡蛋清溶菌酶;
2.低分子量标准蛋白;
3.粗酶。
其中标准分子量蛋白分别为:
鸡蛋清溶菌酶(14.4KDa)、胰蛋白酶抑制剂(20.1KDa)、牛碳酸酐酶(31.0KDa)、兔肌动蛋白(43.0KDa)、牛血清白蛋白(66.2KDa)、兔磷酸化酶B(97.4KDa)。
实验四、纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析
了解各环境因素(如:
温度、pH值等)对酶稳定性的影响。
了解衡量酶稳定性的指标:
半衰期T1/2。
酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响而保持其活性的能力,酶的稳定性在生产应用上具有重要的意义。
酶的稳定性常用半衰期(T1/2)来衡量,其表示一定条件下酶活力丧失50%所需的时间。
一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。
溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型。
以E和D分别表示活性酶与失活酶,则失活反应方程式可以表示为:
式中Kd和Kr分别表示正反应和逆反应的速度常数,因是不可逆失活反应,故Kr=0。
令时间为t时活性酶的浓度为[E]t,酶活性为At,则有:
根据式
(1),以
对处理时间t作图其斜率即为
。
进而通过式
(2)便可求得半衰期(T1/2)。
三、材料、试剂
实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶、指形管等。
2.试剂和仪器:
0.5mol/LNaOH;
pH计。
四、实验步骤
1.取亲和层析所得的纯化溶菌酶用蒸馏水稀释5倍后(此时溶菌酶所处的环境为酸性的醋酸溶液),分装入5根指形管中,每管0.5mL,放入75℃水浴中保温,分别处理0,10,20,40,60min后取出,在自来水下冷却,测定酶液的残留活力,以未经处理(即0min)的酶液活性为100%,计算其它加热处理酶液的相对活力,并以“相对活力”对“加热处理时间”作图。
2.同时取稀释后的纯化溶菌酶5mL,在pH计上用0.5mol/LNaOH将酶液的pH值调至8.0左右(此时溶菌酶所处的环境为中-偏碱性的溶液,此步调pH值特别关键,避免过碱或过酸!
),分装入5根指形管中,每管0.5mL,同步骤1将其放入75℃水浴中加热,处理0,
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