金针菇酶解活性肽及其自由基清除率的研究docWord格式文档下载.docx
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StudyonEnzymolysisActivepeptideofFlammulina
andRadicalscavenging
Abstract
Tostudythecombinedacidproteaseandpapainhydrolysismushroomprotein,optimumantioxidantpeptidepreparationparameters,asrawmaterialsinthisexperimentmushroom,mushroombybeating,adjustpH,temperatureregulation,digestion,enzymeinactivation,centrifugationFinaly,hydrolysatesobtainedforanalysisdeterminedbysinglefactorexperimentandresponsesurfacedesigntothedegreeofhydrolysis,superoxideanionscavengingrate,indictorsofhydroxylradicalscavengingwastostudytheenzymehydrolysisofthemostactivepeptideFlammulinaoptimalprocessparameters.Dextrangelchromatographyusingoptimumconditionsdeterminedbytheenzymepeptidemolecularweight,bymeasuringtheenzymesolutionsoakedinperoxidevalueofpeanuts,peanuthydrolyzateverifytheantioxidantactivity.Resultsareasfollows.
1.Single-factortestresultsshowthattheoptimalhydrolysistimeof3hoursthebestenzymeconcentrationis0.6%,thebestenzymeratioof1:
1,pH4,thetemperatureis55℃.
2.Responsesurfaceoptimizationresultsshowthattheimpactofthethreeindicatorsinorderofenzymedosage>
hydrolysistime>
enzymeratio.Intheoptimalconditionsofeachindex,degreeofhydrolysis10.8%,superoxideanionscavengingrate53.68%,hydroxylradicalscavengingratewas86.7%.
3.MeasuredbySephadexchromatographywas:
AfterhydrolyzateobtainedafterSephadexchromatography,themolecularweightpeptidefragmentsmostlyintherangefrom2000to6600.
4.Thedeterminationofpeanutsoakedhydrolyzateperoxidevalueoftheexperimentalresultshowedthat:
peanutsoakedinenzymaticsolutionofperoxidecontentincreasedslowerthaninwaterandtheconcentrationofbigisbetter.Keptfor60daysafterthepeanutssoakedwithwatertheperoxidevalueof0.026%,with50%concentrationoftheenzymesolutionsoakedintheperoxidevalueofpeanut0.0219percent,with100%concentrationofhydrolyzateperoxidesoakedvalueof0.0186percent.
【keyword】FlammulinaProteaseDegreeofhydrolysisRadicalscavengingMolecularweight显示对应的拉丁字符的拼音
字典-查看字典详细内容
1.3试验方法........................................................2
1.3.1
...................................................2
1.3.2
................................2
1.3.3
....................................................2
1.3.4
............................................2
1.3.5
..................................2
1.3.6
..............................2
1.3.7
..............................3
1.3.8
......................3
1.3.9
..........................................3
2结果与分析4
2.1.4
5
2.1.5
2.2响应面试验6
2.2.1双酶水解对水解度的影响6
2.2.2双酶水解对自由基清除率的影9
2.3酶解液中活性肽分子量的分布14
2.4酶解液对花生的抗氧化性15
金针菇解活性肽及其自由基清除率的研究
学生:
刘丹指导老师:
0前言
活性肽是一种具有特殊生理功能的肽,是氨基酸的聚含物。
活性肽的抗氧化比蛋白质和氨基酸更为显著,抗氧化肽具有清除重金属、促进过氧化氢分解、抑制多酚氧化酶、降低自氧化速率、减少脂肪中过氧化氢含量、减少自由基生成作用[1]。
现在,抗氧化肽的研究已经引起了学术界的广泛关注。
金针菇是一种能在秋冬与早春栽培的食用菌,以其滑嫩的菌盖、鲜脆的菌柄、丰富的营养、鲜美的味道,舒适爽口而著称于世。
金针菇不仅味道鲜美,营养丰富,而且有很好的保健价值[2]。
金针菇含有18种氨基酸,其中包括人体必需的8种氨基酸,尤其是赖氨酸含量特别丰富,具有促进儿童的健康成长和智力发育,国外称之为“增智菇”[3]。
金针菇具有明显的抗HIV(艾滋病病毒)、抗肿瘤、改善免疫系统功能,调节血糖血脂及胆固醇水平、降低血压等作用,可有效防止癌细胞的生成和转移,对艾滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能紊乱都有很好的疗效,且无任何毒副作用[4]。
金针菇除作为菜肴外,还要加工一些盐渍品、酱渍品、罐藏品等,还能做金针菇干,市场需求量大,开发前景诱人[5]。
目前,世界各国对于金针菇抗氧化肽的报道还很罕见。
本实验以新鲜的金针菇为原料,以水解度、超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率为指标,采用响应面分析法对复合蛋白酶酶解金针菇蛋白质的工艺进行了研究,得到了最佳的酶解条件,首次制备了金针菇的抗氧化肽,并对获得的抗氧化肽进行葡聚糖凝胶柱层析分离,分析相对分子质量分布,同时也为金针菇的深加工以及提高其利用价值提供了一条可行的途径。
1试验材料和方法
1.1
金针菇(在银河超市购买)
铁溶液、
细胞色素C,上海如吉生物科技有限公司;
甲基橙(实验室提供);
维生素B12(购买于药店);
;
葡聚糖凝胶Sephadex-50;
1.2
303-0型台式培养箱北京市永光明医疗仪器厂
电热恒温水浴锅LSY北京医疗设备厂;
电子天平FA-04上海天达仪器有限公司
HY—4
GZX-9246NVBE
pH-3C
上海天达仪器厂
RJ-TDL-40C
RE-52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂
DS-1
1.3方法
1.3.1
新鲜的金针菇→清洗→切碎→称量→加水→组织捣碎
首先购买新鲜优质的金针菇供实验用,要求金针菇新鲜而且均匀,无虫害无杂物。
先将50g金针菇准确取称取,切碎,再加水200mL,在打浆机中将金针菇打浆。
大约10min左右。
将打浆制得的金针菇浆液,放入三角瓶中,调节其至所需的温度和pH,加入一定量的木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶,复合水解一定的时间后,取出成液体的三角瓶放入100℃的沸水锅中再保持10min灭酶后,把三角瓶取出迅速冷却后,将酶解液等量装入离心管,在2800r/min的离心机下离心10min,取上层清液。
单因素的实验条件为:
酶的加入为量0.6%,酶配比2:
1,温度55℃,时间4h,pH为4。
分别考察其酶用量、酶配比、温度、时间和pH对水解度、超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率的影响,反应结束后在100℃的沸水锅中灭酶10min,然后将酶解液在2800r/min的离心机下离心20min,取上层清液,测定其水解度,羟基自由基清除率,超氧阴离子清除率。
各因素的浓度梯度分别如下:
酶用量为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%;
酶配比为3:
1、2:
1、1:
2.、1:
3;
温度为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃;
时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h;
pH值为2、3、4、5、6。
在单因素的实验结果的基础上,确定复合酶的酶解条件,采用Design-Expert软件中的实验设计原理,以酶用量、酶配比和时间为自变量,以水解度,超氧阴离子,羟基自由基为响应值,
。
试验的因素和水平的取值见表1。
表1响应面试验因素水平表
Table1FactorsandlevelsofRSM
试验水平
Level
因素Factor
时间A/h酶配比B酶用量C/%
TimeEnzymerationEnzyme
-132:
10.4
041:
10.6
151:
20.8
采用甲醛滴定法[6]参照参考文献[6]的方法进行测定,根据实验材料的特点有所改动。
采用邻苯三酚自养化法[7-8]参照参考文献[7-8]的方法,进行测定,在实验的过程中,邻苯三酚氧化的非常快,每测定一组样品,需要重新配一次,而且要避光放置。
1.3.7
采用水杨酸乙醇法测定[9-11]参照参考文献[9-11]的方法,进行测定,在实验的过程中,根据实验材料的要求及实验室的条件有改动。
1.3.8
(1)葡聚糖凝胶层析柱的制备[12-13]参照参考文献[12-13]的方法进行测定,由于实验条件的限制,在具体操作时有所改动。
(2)标准洗脱曲线的建立[14]参照参考文献[14]的方法进行测定,由于实验实验材料的分子量的分布特点,在试验具体操作时有所改动。
(3)
取在最佳条件下制得的酶解液的上清液,置于旋转蒸发仪中蒸发浓缩,浓缩至原体积的40%,在微波炉中灭菌3min,冷却后,在一次性过滤器中过滤三次,得到淡黄色的透明液体,取该液体1mL加入层析柱,洗脱液流速为2.2mL/管,人工收样,在280nm处测定吸光度值,,对峰值处的活性肽的相对分子质量进行测定。
]参照参考文献[15]的方法进行测定,实验分为标准曲线的建立和样品的测定,花生的过氧化值用I2的ug数来表示。
2结果与分析
2.1
2.1.1
将新鲜的、清洗干净的金针菇准确称取50g,加200g的蒸馏水,打浆之后,准确称量等量的5份,将pH值为调节为4,加入0.6%的酶量,酶配比为1:
1,在温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的水浴锅中酶解4h,之后在沸水中灭酶10min,研究不同温度对金针菇抗氧化肽制备的影响。
结果显示如下图所示
图1温度对抗氧化肽的影响
Fig.1Effectoftemperatureonantioxidantpeptide
结果分析:
一般在酶有活性温度的范围内,水解反应随着温度的升高而加快,当超出了最适合的温度就会下降。
由图中看出:
在55℃时,水解度达到最大值9.6%,金针菇活性肽的自由基清除率也是增强,在55℃时,羟基自由基的清除率达到其最大值80%,而在60℃时,超氧阴离子清除率达到最大值58.7%,在55℃时次值为46.2%,此后温度再升高,自由基清除率略有所下降,综合选择,最适温度应该在55℃。
2.1.2
本实验分析了其他的单因素条件在其中间值时,取酶解1h、2h、3h、4h、5h、6h对金针菇抗氧化肽制备的影响,结果如下图所示:
图2酶解时间对抗氧化肽的影响
Fig.2Effectoftimeonantioxidantpeptide
由图可知,随着酶解时间的延长,各个指标都在增大,酶解到4h时,水解度达到其最大值10.3%,超氧阴离子清除率达到其最大值55.6%,羟基自由基清除率达到其最大值66.8%,在4h时,羟基自由基清除率的增大尤为明显,4h之后,三个指标都有所下降,因此选择的酶解时间为4h。
2.1.3
本实验分析了其他的单因素条件在其中间值时,取酶解pH值分别为2、3、4、5、6时对金针菇抗氧化肽制备的影响,结果如下图所示:
图3酶解pH值对抗氧化肽的影响
Fig.3EffectofpHonantioxidantpeptide
pH值的变化会影响酶解反应,由上图可以看出,随着pH值的增加,水解度在一定的范围内增大,当pH值为4时,水解度达到其最大值10.4%,超氧阴离子达到其最大值46%,羟基自由基清除率达到其最大值74.4%。
当超过4以后,水解度和自由基清除率都有所下降,到了pH值为6时,自由基的清除率又有所升高,但是也没有达到最大值,所以最适pH值为4。
本实验分析了其他的单因素条件在其中间值时,酶配比为3:
1、2:
2、1:
3时对金针菇的抗氧化肽制备的影响,结果如下图所示:
图4酶配比对抗氧化肽的影响
Fig.4Effectofenzymesrationonantioxidantpeptide
酶配比会影响金针菇的水解效果,进而影响自由基的清除率,当两种酶的配比为1:
1时,水解度达到最大值9.7%,自由基清除率的效果是最好的,超氧阴离子的清除率达到最大值42.16%,羟基自由基的清除率达到最大值80.3%,因此选择1:
1。
本实验分析了其他的单因素条件在其中间值时,酶用量为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%时对金针菇抗氧化肽制备的影响,结果如下图所示:
图5酶用量对抗氧化肽的影响
Fig.5Effectofenzymesonantioxidantpeptide
一定范围内,随着酶用量的增加,水解度增大,自由基清除率增强,当酶用量为0.6%时,水解度达到最大值10.6%,超氧阴离子达到最大值52.65%,羟基自由基清除率达到最大值85%,当超过0.6%时,水解度有所下降,羟基自由基的清除率有所下降,超氧阴离子的清除率变化微小,因此,最佳的酶用量为0.6%。
2.2响应面试验
2.2.1
表2水解度响应面设计结果
Table2ExperimentalresultsofDH-RAM
实验处理号Std
试验次数Run
A时间hTime
B酶配比Enzymesratio
C酶用量%Enzyme
水解度%
DH
4
1
-1
8.62
2
8.94
14
3
7.92
9
10.80
5
9.13
10
6
8.68
8
7
8.54
12
10.23
8.71
8.52
11
9.70
8.91
13
10.54
15
9.28
9.45
上表2为对金针菇酶解活性肽水解度的响应面的设计的结果,对试验的结果采用的是Design-Expert6.0.10Trial软件的ANOVA程序,对它进行二次回归分析,可以得到影响水解度及其各因素变量间的标准回归方程式:
如下
DH=-5.83630+4.8992P1+1.9441P2+16.4552P3+0.2733P1P2-0.4250P1P3+3.1667P2P3-0.6667P12-1.9230P22-18.4167P32
由回归方程可知,加酶量的二次项系数是最大的,为18.4167,而其于两个二次项分别为1.9230和0.6667。
响,高于酶配比和时间的影响。
交互项P1P3和P2P3的系数也比较大,为0.4250和3.1667,所以影响也比较显著,而二次项P12、P22和P1P2对其影响不显著。
这表明各个具体试验的因素对
表3水解度(DH)方差分析结果
Table3VarianceanalysisofDHexperiment
变异来源
平方和
自由度
均方
F值
P值
显著性
Source
SS
df
MS
F-Value
P-value
Significant
Model模型
8.37
0.93
5.13
0.0433
significant
A-A
0.21
1.17
0.3297
B-B
0.076
0.42
0.5458
C-PH
5.00
2.758
0.9874
AB
0.17
0.3798
AC
0.029
0.16
0.7062
BC
0.90
4.98
0.0761
A2
1.64
9.05
0.0298
B2
4.32
23.82
0.0045
C2
2.00
11.05
0.0209
残差Residua
0.91
0.18
失拟误差
LackofFit
0.74
0.25
2.81
0.2570
notsignificant
纯误差
PureError
0.81
总和
CorTotal
响应面结果分析:
分别将模型中的时间(A,h)、酶用量(B,%)、复合酶配比(C,1)的其中一个影响因素确定为在0水平,然后我们可以得到另外的两个因素的交互作用它对水解度的
由图6可知,当固定在C=0,水解度的较高值落在A=3.5h-4.8h、B=0.88:
1-1.63:
1的范围内;
当固定在B=0时,的较高值落在A=3.5h-4.7h、C=0.5%-0.7%的范围内;
当固定在A=0时,水解度的较高值落在B=0.88:
1-1.64:
1、C=0.42%-0.76%的范围内。
在此范围内,水解度的高值居于10.2%以上。
而且从图6中可以看出,3个因素与DH的关系呈抛物线,当各因素的值增加,水解度也是增加,
定值后,水解度值则呈下降趋势。
一般情况下,在最合适的酶解条件下,增加酶用量、提高酶配比或延长酶解时间都会使酶解产物的水解度提高。
但从图中可以看出酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解金针菇所得产物的水解度并不需要最大的酶用量,最高的酶配比,最长的时间,本试验结果与其是相符合的。
图6酶解产物水解度的响应面及等高线
Fig.6ResponsesurfaceandcontourlinesofDH
2.2.2
表4自由基清除率响应面设计结果
Table4Experimentalresultsofeliminationrate-RAM
实验处理号Std
试验次
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