476体外哺乳动物细胞基因突变试验Word文档下载推荐.docx
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移码型致突变物(frameshiftmutagens):
引起DNA分子中增加或丢失一个或多个碱基对置换的化学物。
表型表达时间(phenotypicexpressiontime):
在新突变的细胞耗尽未改变的基因产物所需的时间。
突变体频率(mutantfrequency):
观察到的突变细胞数除以存活细胞数。
相对总生长(relativetotalgrowth):
经过整个时期与阴性对照细胞群比较的细胞数增加,计算为相对于阴性对照的悬浮生长与相对于阴性对照的集落形成效率的乘积。
相对悬浮生长(relativesuspensiongrowth):
经过表达期相对于阴性对照的细胞数增加。
表达存活率(viability):
在表达期后接种选择培养基时的处理细胞的集落形成效率。
处理存活率(survival):
在处理期末,处理细胞的集落形成效率。
通常表达为对照细胞群存活率的相对数。
3试验原理
体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验,遗传学终点为细胞基因突变。
,,,,//由于TK突变成TK,引起细胞缺乏胸苷激酶(TK),细胞对嘧啶同型物三氟胸腺,,/嘧啶(TFT)的细胞毒作用具有耐受性。
TK细胞对TFT敏感,TFT引起细胞代谢抑制和,,,,//细胞分裂停止,而突变细胞在TFT存在时能增殖,故TFT可作为TK细胞和TK细胞的选择剂。
与此相似,HPRT或XPRT未突变的细胞对6-硫代鸟嘌呤(TG)或8-氮杂鸟嘌呤(AG)敏感。
当试验与选择剂结构相关的化学物时,必须证实选择系统/选择剂的可行性。
在有和无代谢活化的条件下,悬浮细胞或单层细胞培养物暴露于受试物适当时间,传
-1-
代测定细胞毒性和进行表型表达,再进行突变体选择。
细胞毒性测定通常利用经染毒后培养物的相对集落效率(染毒存活率)或相对生长。
经染毒的培养物在培养液中培养一定时间,以允许诱发的突变体表型表达。
在含选择培养液中接种已知数量的细胞,来测定突变体集落数,并在无选择剂的培养液中测定集落生成效率(表达存活率)。
经适当的培养时间,计数集落。
突变体频率是在选择培养液中突变体集落数除以在无选择剂培养液中集落数。
4操作方法和程序
4.1准备
4.1.1细胞
(1)多种细胞可用于本试验,包括L5178Y、CHO、CHO-AS52、V79或TK6细胞。
本试验所用的细胞类型应该证实对化学致突变物敏感,集落形成效率高和自发突变频率稳定。
应核实细胞无支原体污染,如有污染,则不应使用。
(2)试验设计应达到预先确定的敏感性和把握度。
细胞数、培养物和受试物浓度应反映这些已确定的参数,在试验每个阶段所用的最低存活细胞数应该根据自发突变频率确定,6所用的的细胞数一般至少为自发突变频率倒数的10倍,推荐至少利用10细胞。
应该有所用细胞系统的本底资料提示此试验系统的稳定性。
4.1.2培养液和培养条件
应根据此试验所用的选择系统和细胞种类选择适当的培养液和培养条件(培养瓶皿、CO浓度和湿度),以保证在表达期内细胞的最佳生长,突变体及非突变体细胞的集落形成2
能力。
4.1.3培养物准备
由贮备培养物接种至培养液,在37?
培养。
培养物在试验前需要去除已存在的突变体细胞。
4.1.4代谢活化
细胞应在有或无适当的代谢活化系统条件下染毒。
最常用的代谢活化系统是以酶诱导剂如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合处理的啮齿类肝制备的去线粒体后组分(S9)及辅因子系统。
S9组分在培养液中终浓度范围为1%,10%V/V。
代谢活化系统的条件可能取决于受试物的类别。
选择细胞系进行代谢活化应有适当理由。
4.1.5受试物/准备
固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂或赋形剂中,在处理细胞前适当稀释。
液体受试物可直接加至试验系统和/或于染毒前稀释。
应该使用新鲜制备的受试物,除非稳定性资料证实可以贮存。
4.2试验条件
4.2.1溶剂/赋形剂
用溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应,并且对细胞存活率和S9活性应无影响。
首先推荐采用水作溶液剂/赋形剂,如果采用不常用的溶剂/赋形剂,应有资料表明其对细胞存活率和S9活性无影响。
4.2.2染毒浓度
(1)在决定最高浓度时应考虑细胞毒性、在试验系统中的溶解性和pH或渗透压改变。
(2)在无代谢活化时,应利用细胞融合程度、存活细胞计数或有丝分裂指数等指标来确定细胞毒性。
预试验可有助于确定细胞毒性和溶解性。
10(3)至少应种用4种染毒浓度。
通常要求浓度组间距为2,倍之间。
在受试物有细胞毒性时,浓度范围应包括最大细胞毒性至几乎无细胞毒性;
最高浓度应导致10,,20
-2-
(但不低于10,)的相对存活率(相对集落生成率)或相对总生长。
对于相对无细胞毒性的化学物,最高浓度应该是5μl/ml,5mg/ml或0.01mol/L,取最低的一种。
(4)对无毒性的相对不溶的受试物,其最高浓度应在处理期末终培养液中有肉眼可见的沉淀。
必要时可在多于一个肉眼可见沉淀的浓度进行试验。
沉淀不应干扰结果计数。
4.2.3对照
(1)每个试验应包括在有和无代谢活化条件下同时进行的阳性和阴性(溶剂/赋形剂)对照。
在利用代谢活化时,阳性对照应是间接致突变物,即需要代谢活化才呈现致突变反应的化学物。
(2)阳性对照物包括:
代谢活化位点化学物CAS号条件
甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate)[62-50-0]
HPRT[759-73-9]乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)
不需要外TK(小集落甲磺酸甲酯(methyl[66-27-3]源性代谢和大信落)methanesulphonate)活化
[62-50-0]甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate)XPRT[759-73-9]乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)
HPRT[50-32-8]苯并(a)芘(benzo(a)pyrene)
环磷酰胺(cyclophosphamide)[59-18-0](monohydrate,
单水合物[6055-19-2])
TK(小集落苯并(a)芘(benzo(a)pyrene)[50-32-8]和大集落)需外源性3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)代谢活化[56-49-5]
n-亚硝基二甲胺[62-75-9](高浓度s-9)(n-nitrosodimethylamine)XPRT
[50-32-8]苯并(a)芘(benzo(a)pyrene)
(3)也可利用其他适当的阳性对照物。
如5-溴脱氧尿苷(5-bromo2’-deoxyuridine)[59-14-3]。
如有可能,可考虑利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。
(4)应在每个收获时间都包括相应的阴性(溶剂/赋形剂)对照。
而且,也应该有未处理对照,除非本底资料证明,所选用的溶剂/赋形剂无细胞毒性或致突变作用。
4.3操作方法
4.3.1受试物处理
(1)在有和无代谢活化系统条件下,以受试物染毒正处于增殖期的细胞。
应有适当的染毒时间(通常3,6h)。
必要时,染毒时间可延长到1个或多个细胞周期。
(2)对每个试验浓度可用双份或单份培养物。
在利用单份培养物时,应增加试验浓度数,以保证有足够数量的培养物供分析(如8个可分析的浓度)。
阴性(溶剂/赋形剂)对照应用双份培养物。
(3)气态或挥发性物质应以适当的方法试验,如用密闭的培养瓶。
-3-
4.3.2染毒存活率,表达存活率和突变频率测定
(1)在暴露期末,细胞经洗涤和培养测定处理存活率(survival)或相对总生长率确定细胞毒性,并进行突变体表型的表达。
(2)经对所测位点新诱发的突变体的最佳表达期(HPRT和XPRT需至少6,8天,TK至少2天)后,细胞分别在选择培养液中测定突变体数,在非选择培养液中测定克隆形成率(表达存活率,viability)。
用以计算突变体频率的表达存活率测定在表达期结束时进行。
+/(3)如受试物在L5178YTK试验为阳性,应在至少一个试验培养物(阳性最高浓度),阴性对照和阳性对照测定集落大小;
如为阴性结果,应在阴性对照和阳性对照测定集落于,+/大小。
在TK6TK试验也应测定集落大小。
5资料和报告
5.1数据处理
(1)资料应包括处理组和对照培养物处理存活率(细胞毒性)和表达存活率、集落数,+/和突变体频率。
当L5178Y/TK试验为阳性结果,应在至少一个受试物浓度(最高阳性浓度)、阴性对照和阳性对照分别计数小集落和大集落。
遗传学损伤广泛的的突变体细胞,倍增时间延长,因此形成小集落。
这样的损伤范围是从整个基因丢失到核型分析可见的染色体畸变。
遗传学损伤不太严重的突变体细胞生长速度相似于亲代细胞,并形成大集落。
(2)应报告存活率(相对集落形成率)或相对总生长。
突变频率应表达为存活细胞中突变体数。
(3)应提供各个培养物的资料,而且应以表格总结所有的资料。
(4)明确的阳性结果不要求证实。
可疑的结果应以进一步试验,最好改变试验条件,包括改变浓度间距和代谢活化条件。
对阴性结果应该证实。
5.2结果和评价和解释
(1)判断阳性结果的标准为,突变体频率有浓度相关性增加和/或在一个或多个浓度有可重复的增加。
结果的生物学重要性应首先考虑。
统计学方法可用以评价试验结果;
但是,统计学意义不应是确定阳性反应的唯一的因素。
(2)如果不符合上述标准的受试物可认为在本系统为阴性结果。
(3)虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果,在少见的情况下,所得到的资料不能对受试物的致突变性进行明确的判断,经多次重复试验,结果仍然是可疑的。
(4)体外细胞基因突变试验的阳性结果表明受试物对培养的哺乳动物体细胞诱导基因突变,可重复的阳性浓度-反应关系是很有意义的。
在试验条件下阴性结果表明受试物对培养的哺乳动物体细胞不诱导基因突变。
5.3试验报告
试验报告必须包括下列信息:
(1)受试物:
鉴定资料和CAS编号(如已知);
理化特性和纯度;
受试物的稳定性(如已知)。
(2)溶剂/赋形剂:
溶剂/赋形剂选择依据;
受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性(如已知)。
(3)细胞:
细胞种类和来源;
细胞培养物数;
细胞代数(如适用);
细胞维持方法;
无支原体污染(如有资料)。
(4)试验条件:
浓度和培养物数选择的理由,如细胞毒性资料和溶解性资料(如有资料);
培养基成分和CO浓度(如适用);
受试物浓度;
所加溶剂和赋形剂容积;
培养温度;
2
培养时间;
染毒时限;
染毒期细胞密度;
代谢活化系统的类型和成分,包括合格标准;
阳性和阴性的对照;
表达期时间(包括接种细胞数,传代和接种方案,如适用);
选择剂;
计数存活细胞和突变体细胞的方法;
判断试验结果为阳性、阴性或可疑的标准。
集落的定义(包括小集落和大集落的标准,如适用)。
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(5)结果:
毒性表现;
沉淀表现;
培养液pH和渗压资料(如测定);
集落大小,至少,+/在阴性对照和阳性对照计数;
对检测L5178YTK小集落突变体的试验室条件;
剂量-反应关系(如可能);
统计学分析(如进行);
同时进行的阴性(溶剂/赋形剂)和阳性对照资料;
对照的本底资料,包括范围、均数和标准差;
突变体频率。
(6)结果的讨论
(7)结论
6试验的解释和评价
(1)体外哺乳动物细胞基因突变试验利用已建立的细胞系或细胞株,所用细胞的选择基于培养的生长能力和自发突变频率的稳定性。
体外进行的试验通常需要利用外源性代谢活化。
应注意避免可能由于pH渗透性或高度细胞毒性等的假阳性结果。
(2)此试验用于筛选可能的哺乳动物致突变物和致癌物。
此试验为阳性结果的很多化学物是哺乳动物致癌物;
但本试验和致癌性之间并无很好的的相关。
相关取决于化学物类别,并且有证据表明此试验未检出的致癌物并不是通过直接损伤DNA的机制起作用的。
7主要参考文献
1OECD:
OECDGuidelinesForTestingOfChemicals.476InvitroMammalianCellGene
MutationTest,1-8.Paris:
OECD&
OCED,Adopted4.Apirl1984.
2国家环境保护局.化学品测试准则(1990).北京:
化学工业出版社,1990.3USEPA,OPPTS.Health-EffectsTestGuidelines.InvitroMammalianCellGeneMutationTest.
1998.
附录
定义
重要中英文术语
正向突变(forwawdmutation)
碱基置换型致突变物(basepairsubstitutionmutagens)
移码型致突变物(frameshiftmutagens)
表型表达时间(phenotypicexpressiontime)
突变体频率(mutantfrequency)
相对总生长(relativetotalgrowth)
表达存活率(viability)
处理存活率(survival)
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- 配套讲稿:
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- 476 体外 哺乳动物 细胞 基因突变 试验
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