血涂片的制备Word文档下载推荐.docx
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此外,还可根据不同需要(如疟原虫、微丝蚴检查等)采用厚血涂片法。
随着当今的自动化的发展,出现了自动血液涂片和染色装置。
自动的血液涂抹装置主要有两类,一类是离心法,可以将少量细胞浓缩涂片;
另一类是机械涂片法,其模拟手工涂片,适用于大量血涂片的制备。
一般来说自动血液涂片装置可获得细胞分布均匀、形态完好的血片,但尚未普遍推广。
思考题
从外观来判断,一张好的血涂片有哪些特征?
血涂片的制备与染色
℃恒温箱保温促干,以免细胞变形缩小.
3.涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞的比容有关.一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚;
反之则血膜薄.
4.涂片应在1h内染色或在1h内用无水甲醇固定后染色.
5.新购置的载玻片常带有游离碱质,必须用浓度约1mol∕LHCL浸泡24h后,再用清水彻底冲洗.
血涂片染色:
瑞士染色法
【原理】
瑞士染色法使细胞既有化学亲和反应,有又物理吸附作用.各种细胞由于其化学成分不同,对酸性及碱性染料的结合力也不同,因此,染色后各种细胞呈现出各自的染色特点.
【试剂】
瑞士染液
Ⅰ液:
瑞士染料
0.1g,甲醇
60.0ml
瑞士燃料有酸性燃料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成.将瑞士染料放入清洁干燥研钵里,先加少量的甲醇,充分研磨使燃染料溶解,将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中,未溶解的在加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解,甲醇全部用完为止.配好后放入室温下,一周后即可使用.新配染液效果较差,放置时间延长,染色效果越好.久置应密封,以免甲醇挥发或氧化成甲酸.染液中也可加中性甘油2~3ml,除可防止甲醇过早挥发外,也可使细胞着色清晰.
Ⅱ
步骤:
采血,推片,干燥,标记,染色
1.采血准备工作:
按摩,消毒,针刺,吸血,止血
2.推片:
一张良好血涂片的要求:
厚薄适宜,头体尾明显,细胞分布均匀,边缘整齐,两端和两边留有空隙
血涂片制备的注意事项:
血滴愈大,角度愈大,推片速度愈快,则血膜愈厚;
反之,血涂片愈薄。
针对不同患者应有的放矢,对血细胞比容高、血粘度高的患者宜采用小血滴、小角度、慢推;
贫血患者则相反。
引起血涂片分布不均的主要原因:
推片边缘不整齐(毛刷状)用力不均匀(阶梯状)载片不清洁(有空泡)
3.干燥:
将推好的血涂片在空气中晃动,使其迅速干燥。
天气寒冷或潮湿时,应于37℃温箱中保温促干,以免细胞变形缩小
4.标记
5.染色:
瑞氏染色法(Wright’sstain)
1.染液成分:
①美蓝(亚甲蓝):
M+碱性染料
②伊红(曙红):
E-酸性染料
③瑞氏染料:
M++E-ME↓(伊-美中性物)
④甲醇:
溶解染料;
固定细胞形态;
蛋白质呈颗粒或网状,增加细胞与染料的接触
2.染色原理:
①基本原理:
物理吸附、化学亲和作用
②碱性物质(Hb、嗜酸性颗粒)――嗜酸性物质、染成粉红色(E-)
③酸性物质(核蛋白、RNA)――嗜碱性物质、染成蓝或紫蓝色(M+)
④中性颗粒(中性细胞胞浆)――嗜中性物质、染成淡紫红色(M+E-)
pH的影响:
H+(pH<
PI):
蛋白质与碱性染料(M+)亲和力下降,增强伊红着色,出现红染
OH-(pH>
蛋白质与酸性染料(E-)亲和力下降,增强美蓝着色,出现蓝染
PBS缓冲液:
pH:
6.4-6.8以维持恒定的pH环境
3.染色方法
①固定:
滴加染液3~5滴,覆盖整个血膜固定细胞0.5-1min
②染色:
加1~2倍PBS缓冲液,混匀染5~10min
③冲洗:
平衡摇动,于自来水龙头上平置冲洗(从一端开始),或加PBS缓冲液冲洗
4.染色结果
①外观:
淡紫红色
②镜下:
红细胞――粉红色碟状白细胞――胞核、胞浆及颗粒显示特有的染色特征
5.红细胞与中性粒细胞
红细胞:
淡红色圆盘状,中央有生理性淡染区。
中性粒细胞:
细胞核染深紫红色,细胞质呈粉红色,含有许多细小的淡粉红色颗粒,淋巴细胞:
细胞核染深紫红色,胞质少,仅在核的一侧见到少量淡蓝色胞质
注意事项:
①血膜要干透后才能染色,否则染色时易脱落;
②染色时间与染液浓度、室温及有核细胞多少有关,一般染液淡、室温低,有核细胞多,染色时间长。
③染液不能过少,以防蒸发沉淀;
④冲洗时不能先倒掉染液,应以细流水从一边开
始冲,防染料沉着,冲洗时间也不能长;
⑤染色过淡时可复染,复染时先将染料稀释好;
⑥染色过深可用水冲洗或浸泡,还可用甲醇脱色;
⑦分类最佳区域为体、尾交界处。
第一节 流动的组织──血液
──血液
一、教学目标
1.描述血液的成分和主要功能。
2.使用显微镜观察人血的永久涂片,尝试识别红细胞和白细胞。
二、教学策略
血液对于每个学生来说既熟悉又陌生。
说学生熟悉血液,是因为每个学生几乎都有流血、抽血和验血的经历,对血液的颜色等有一些感性的认识,还可以从报刊、杂志、电视和广播中获取到有关血液的信息。
说学生对血液陌生,是因为学生大都不知道血液里到底含有哪些成分,以及每种成分各有什么功能。
总之,学生对血液感到很新鲜,甚至有一些恐惧。
因此,教师可以先让学生自由发言,交流各自对血液的认识,以激发学生的学习兴趣。
然后,教师可以出示一张医院的血液化验单,让学生回忆和讨论血液化验的主要内容。
教师可以将学生的回答记录在黑板上,为后面的教学做铺垫。
当然,学生的回答往往不很全面,不很系统。
这时,教师不要忙着补充,而是要及时评价学生从生活经验和课本外获取信息的能力,鼓励学生继续积极补充,再进行归纳,为下一步的教学打好基础。
教师可以将课前准备好的血液分层演示装置(可以用鸡、鸭或家鸽的血,也可以用猪、牛或羊的血)演示给学生看,并让学生讨论资料分析中的3个问题。
关于血浆,教师只需作简要的介绍。
需要指出的是,水占了整个血浆的绝大部分,这可以为后面介绍无偿献血做铺垫。
关于血细胞,教材的意图是让学生先通过显微镜观察人血的永久涂片,从感性上认识红细胞、白细胞的形态以及数量多少,然后从理性的角度进行学习,这样做可以激发学生自主学习、积极开动脑筋和主动求知的学习热情。
在这一部分内容的教学中,教师介绍红细胞、白细胞和血小板的主要功能时,应该特别注意与生活实际中的一些问题相联系,如贫血、化脓和伤口处血液逐渐凝固等,这有助于调动学生的学习积极性,并加深学生对基础知识的理解和记忆。
三、参考答案
资料分析
1.血液中含有不同的组成物,它们的质量不一样,所以,含有抗凝剂的血液离心或静置一段时间后,就会逐渐分成上下两层以及中间一薄层白色物质。
2.血液是由上层的淡黄色半透明液体,下层深红色部分以及中间的很薄的一层白色物质组成的。
红细胞和所含的血红蛋白在下层深红色的物质里,白细胞和血小板在中间很薄的一层白色物质中。
3.血液中有大量的血细胞,这些细胞与血浆共同构成血液,完成物质运输等功能,因此,血液是一种组织,属于结缔组织。
血液可以流动,因此称做“流动的组织”。
实验
1.数量最多的是红细胞。
2.红细胞呈两面凹的圆饼状,红色,数量多,不用染色就可以观察到;
白细胞的个体比红细胞大,数量少,只有经过染色才能观察清楚。
3.血小板比红细胞和白细胞小许多,并且需要进行特殊的染色,所以在光学显微镜下看不到血小板。
练习
1.大量出汗时,血液主要丢失水分和一部分无机盐。
通常采用喝水和适量补充无机盐的方法,来补充血液中丢失的这些成分。
严重腹泻时,人体主要丢失水分、一部分无机盐和葡萄糖等营养物质。
通常采用喝水、适量补充无机盐以及静脉滴注(或口服)葡萄糖溶液等方法来补充血液中丢失的这些成分。
2.贫血患者的症状是:
面色苍白并有头昏、乏力、心悸、气急等症状。
血红蛋白是一种含铁的蛋白质,一般地说,贫血患者应当多吃一些含铁的食物和蛋白质丰富的食物。
3.昆明属于高原地区,同平原地区相比,空气中氧的含量比较少。
在这种环境下集训,可以增加足球运动员血液中血红蛋白的含量,从而增强足球运动员血液的供氧能力。
4.白细胞吞噬了病菌和死亡的细胞后,自己也会死亡,所以白细胞的寿命比较短。
四、背景资料
人血常规化验单说明表
下表是我国有关RBC、WBC、Hb和PLT的正常参考值和说明。
检查项目
正常参考值
说明
英文缩写
中文名称
RBC
红细胞
计
数
男:
(4.0~5.5)×
1012个/L
女:
(3.5~5.0)×
1012个/L
人体在运动、饱食和缺氧等情况下,红细胞数会暂时增加。
贫血时,红细胞数会明显减少。
WBC
白细胞
(4~10)×
109个/L
人体在失血、剧痛、烧伤、炎症、白血病等,以及女子月经、妊娠和分娩期时,白细胞数会明显增加。
在药物中毒、骨髓造血机能损害等时,白细胞数会明显减少。
Hb
血红蛋白
120~160g/L
110~150g/L
贫血时,血红蛋白含量会明显减少。
PLT
血小板
(100~300)×
血小板数过少,机体会异常出血。
血小板数过多,机体易形成血栓等。
实验用血的采取
取血时必须注意两点:
一是要取新鲜的血液;
二是应该在取出的新鲜血液中立即加入一定量的抗凝剂,以免血液凝固。
具体做法是:
取一个试管,滴入几滴抗凝剂,如质量分数为5%的柠檬酸钠溶液,再注入3~5mL(多注入数毫升,效果更明显)哺乳动物的血,轻轻震荡试管,使血与抗凝剂混合均匀。
下面简单地介绍一下用心脏穿刺法从活家兔体内取血的方法。
一个人用左手握住家兔的耳朵和前肢,用右手握住家兔的尾巴和后肢,将兔仰放在实验台上。
另一个人用手摸出家兔心脏跳动最强的部位,剪去该处的兔毛,用酒精消毒,然后用消毒过的注射器(取血之前,要在注射器针管内注入一点儿抗凝剂,以免取出的兔血凝固),刺入家兔的心脏抽取血液(约几毫升)。
取血之后,家兔还可能正常活下去。
取得的血待静置几小时以后,血细胞全部沉降下去,血浆浮在上面,血液就明显地分成血浆和血细胞两部分。
红细胞、白细胞和血小板在人体内的种类、形态、大小、数目和作用
红细胞
成熟的红细胞没有细胞核,呈两面凹的圆饼状,平均直径只有7.7μm,成年人每立方毫米血液里红细胞的数量,男子平均为4.0~5.5×
1012个/L,女子平均为3.5~5.0×
1012个/L。
红细胞具有运输氧的功能,此外,红细胞还能运输一部分二氧化碳。
白细胞
白细胞有多种,都有细胞核,比红细胞大,但数量少,每升血液里只有4~10×
109个。
有些白细胞可以吞噬病菌,对人体起着防御和保护的作用。
人们根据白细胞里是否含有特殊染色颗粒,将白细胞分为粒细胞和无粒细胞两大类。
粒细胞又可以根据所含的特殊颗粒染色性质的不同而分为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
无粒细胞包括单核细胞和淋巴细胞。
人体处在正常情况时,外周血液内各种白细胞的数量有一定的比例。
人体发生炎症或其他疾病时,血液内白细胞的总数或白细胞分类百分比就会发生变化,所以白细胞的分类计数,常被用作诊断疾病的检查方法之一。
现将正常人白细胞的分类计数和各种白细胞的主要功能列表(表6)如下:
表6
正常人白细胞分类计数范围和各种白细胞的主要功能
名
称
百分比
主要功能
粒
细
胞
嗜中性粒细胞
50~70
以变形运动方式,穿出小静脉壁,进入感染发炎的结缔组织中,吞噬和消化侵入人体的各种病菌,清除损伤和死亡的各种组织细胞。
所以,急性感染时增多。
嗜酸性粒细胞
3~5
与过敏反应有关,在过敏或有寄生虫病时增多。
此外,它还与抗原抗体复合物有亲和力,并能吞噬抗原抗体复合物,消除复合物对组织的有害作用。
嗜碱性粒细胞
0~1
能产生和贮存组织胺和肝素。
与人体的过敏反应有关。
无
淋巴细胞
25~40
有变形运动的能力,在人体免疫过程中起重要作用。
单核细胞
2~8
也有活跃的变形运动和吞噬活动,还能协助淋巴细胞在免疫中发挥作用。
血小板
血小板比红细胞和白细胞都小得多,形状不规则,没有细胞核。
每升血液中的含量为100~300×
103个,血小板有止血和加速凝血的作用。
血红蛋白特性的观察(演示)
取一试管加有抗凝剂的血液,待血细胞沉淀后,倒去上层的血浆和部分血细胞,观察留在试管内的红细胞呈暗红色。
然后将试管倾斜放置,10分钟以后,斜面的红细胞呈鲜红色,试管底部的红细胞仍为暗红色。
说明血红蛋白与氧结合或分离的条件与周围环境中氧气的多少有关。
斜面上的红细胞,在空气中已暴露了一段时间,红细胞中的血红蛋白与氧结合,形成了鲜红色的氧合血红蛋白,而试管底部的红细胞,接触空气少,仍呈暗红色。
从上述现象来分析,血红蛋白的特性是:
在氧浓度高的地方容易与氧结合;
在氧浓度低的地方又容易与氧分离。
贫血
贫血有缺铁性贫血和营养不良性贫血两种。
缺铁性贫血
缺铁性贫血是由于人体内缺少铁元素,使红细胞中的血红蛋白含量减少而造成的一种贫血症。
贫血时,患者表现出面色苍白,头晕,精神不振,身体消瘦,肌肉软弱无力,抗病能力差等症状。
引起这类贫血有三方面原因:
(1)生长快,对铁的需求量猛增。
据估计,3~10岁的儿童需铁10mg/日,而到了青春期就高达15~18mg/日,比成人需要量高几倍。
一旦铁的摄入量不足,就会引起缺铁;
(2)因外伤而大量失血,或因钩虫病、肠息肉而慢性失血,以及女孩青春期出现月经初潮等,都会使体内贮铁量下降而缺铁;
(3)因缺乏营养知识,膳食中铁的摄入量不足而缺铁。
纠正缺铁性贫血除应及时彻底治愈造成失血的疾病以外,还应该增加铁的摄入量。
增加铁的摄入量的关键在于饮食。
贫血患者应该多吃一些含铁丰富的食物,如肝脏、动物血、瘦肉、豆腐、木耳、虾皮、海带等,这些食物都有助于治愈贫血症。
营养不良性贫血
营养不良性贫血是由于体内缺乏维生素B12和叶酸引起的。
患者的血红蛋白浓度往往正常,但是红细胞的数量少,红细胞的体积比正常大。
此病的主要症状是:
口、唇、指甲等处明显苍白,皮肤蜡黄,颜面浮肿,精神状态差,反应迟钝,患者还常常合并缺铁性贫血。
纠正营养不良性贫血的方法是:
一旦确诊,可以在医生的指导下口服叶酸、维生素C,并且肌肉注射维生素B12,同时改善饮食,多吃牛肉、猪肝、绿叶蔬菜和水果等。
还应该配合治疗缺铁性贫血,否则不会取得良好的疗效。
血液凝固
血液由溶胶状态变为凝胶状态的血凝块,这一现象叫做血液凝固。
血液流出人体血管就会发生凝固。
血液凝固是一系列复杂的化学连锁反应的结果,其最后阶段是由原来溶解于血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。
纤维蛋白像细丝一样,在形成过程中相互交错重叠,并把血细胞网罗在内,使原来呈溶胶状态的血液逐渐变成凝胶状态的血凝块。
血凝块形成以后,由于血小板收缩蛋白的收缩作用,使血凝块回缩变硬,同时析出淡黄色透明的液体──血清。
血管内循环着的血液一般不会发生凝固,主要原因是:
(1)正常的心脏和血管的内膜光滑,不致发生血小板的破坏;
(2)血液中有抗凝物质,如肝素是体内产生的一种较重要的抗凝物质。
它可以抑制凝血酶原转变为凝血酶,从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白;
(3)血浆中还有使已形成的纤维蛋白溶解的物质,可以随时将血管内已形成的纤维蛋白溶解。
人血涂片的制作
有条件的学校可以让学生制作人血涂片,以便认识红细胞和白细胞。
所需材料和用具:
脱脂棉,已消毒过的针和载玻片,体积分数为75%的酒精。
人血涂片的制作过程,可以按照下列各图(图15)及对各图的说明进行。
干细胞研究及其意义
分化后的细胞,往往由于高度分化而完全丧失了再分化的能力,这样的细胞最终将衰老和死亡。
然而,动物体在发育的过程中,体内却始终保留了一部分未分化的细胞,这就是干细胞。
干细胞又叫做起源细胞、万用细胞,是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
可以这样说,动物体就是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新,从而保证动物体持续生长发育的。
干细胞根据其分化潜能的大小,可以分为两类:
全能干细胞和组织干细胞。
前者可以分化、发育成完整的动物个体,后者则是一种或多种组织器官的起源细胞。
人的胚胎干细胞可以发育成完整的人,所以属于全能干细胞。
早在19世纪,发育生物学家就知道,卵细胞受精后很快就开始分裂,先是1个受精卵分裂成2个细胞,然后继续分裂,直至分裂成有16至32个细胞的细胞团,叫做桑椹胚。
这时如果将组成桑椹胚的细胞一一分开,并分别植入到母体的子宫内,则每个细胞都可以发育成一个完整的胚胎。
这种细胞就是胚胎干细胞,属于全能干细胞。
骨髓、脐带、胎盘和脂肪中则可以获取组织干细胞。
每个人的体内都有一些终生与自己相伴的干细胞。
但是,人的年龄越大,干细胞就越少。
为了弥补干细胞的不足,一些科学家建议从胚胎或胎儿以及其他动物身上获取干细胞。
进行培养和研究。
干细胞的用途非常广泛,涉及到医学的多个领域。
目前,科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞,并以这样的干细胞为“种子”,培育出一些人的组织器官。
干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用,将产生一种全新的医疗技术,也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官,从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官,来替换自身病变的或衰老的组织器官。
假如某位老年人能够使用上自己或他人婴幼儿时期或者青年时期保存起来的干细胞及其衍生组织器官,那么,这位老年人的寿命就可以得到明显的延长。
美国《科学》杂志于1999年将干细胞研究列为世界十大科学成就的第一,排在人类基因组测序和克隆技术之前。
新加坡国立大学医院和中央医院通过脐带血干细胞移植手术,根治了一名因家族遗传而患上严重的地中海贫血症的男童,这是世界上第一例移植非亲属的脐带血干细胞而使患者痊愈的手术。
医生们认为,脐带血干细胞移植手术并不复杂,就像给患者输血一样。
由于脐带血自身固有的特性,使得用脐带血干细胞进行移植比用骨髓进行移植更加有效。
现在,利用造血干细胞移植技术已经逐渐成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。
科学家预言,用神经干细胞替代已被破坏的神经细胞,有望使因脊髓损伤而瘫痪的病人重新站立起来;
不久的将来,失明、帕金森氏综合症、艾滋病、老年性痴呆、心肌梗塞和糖尿病等绝大多数疾病的患者,都可望借助干细胞移植手术获得康复。
同胚胎干细胞相比,成人身体上的干细胞只能发育成20多种组织器官,而胚胎干细胞则能发育成几乎所有的组织器官。
但是,如果从胚胎中提取干细胞,胚胎就会死亡。
因此,伦理道理问题就成为当前胚胎干细胞研究的最大问题之一。
美国政府明确反对破坏新的胚胎以获取胚胎干细胞,美国众议院甚至提出全面禁止胚胎干细胞克隆研究的法案。
美国的一些科学家则对此提出了尖锐的批评,他们认为,将干细胞用于医学研究,在减轻患者痛苦方面很有潜力。
如果浪费这样一个绝好的机会,结果将是悲剧性的。
我国的干细胞研究和应用已经具备了一定的基础,早在20世纪60年代就开始了骨髓干细胞移植方面的研究,目前研究和应用得最多的是造血干细胞。
1992年,我国内地第一个骨髓移植非亲属供者登记组在北京成立,“中华骨髓库”也正式接受捐赠。
2002年,北京建立了脐带血干细胞库。
关于胚胎干细胞的研究,我国目前还没有明确的法律规定。
吉姆萨(Giemsa)染色法:
吉姆萨染液由天青,伊红组成。
染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结果,染粉红色,称为嗜酸性物质;
细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染紫蓝色,称为嗜碱性物质;
中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染淡紫色,称为中性物质。
PH对细胞染色有影响。
细胞各种成分均不蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,所带电荷随溶液PH而定,在偏酸性环境中下在电荷增多,易与伊红结合,染色偏红;
在偏三性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。
因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感,染色用正经片必须清洁,无酸碱污染。
配制顼特液必须用优质甲醇,稀释染色必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则可导致各种细胞染色反应异常,以致识别困难,甚至造成错误。
原文连接如下
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www.yeec/bbs/dispbbs."
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_blank"
www.yeec/bbs/dispbbs./a...;
ID=7459&
page=3
一般性操作技术血涂片制备;
细胞染色;
显微检查;
血液病诊断;
染色不良;
瑞特(Wright)染色法;
酸性染料;
伊红;
碱性染料;
亚甲蓝;
吸附作用;
PH对细胞染色的影响;
甲醇;
吉姆(Giemsa)染色法春天要常用润肤剂,它含有松香油脂酸和丰富维生素a,常用可加快皮肤血液循环,剌激面部细胞分泌,有效改善皮肤生理环境,减少气候对皮肤的危害。
第二节血涂片的制备和细胞染色
血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法,临床上应用极为广泛,特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值,近年来血细胞分析仪的广泛应用,血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。
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- 涂片 制备