浙大考研分子生物学重点Word下载.docx
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前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,
质粒的不相容性:
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒中的一种,这种现象称质粒的不相容性。
碱法提质粒的原理:
用含SDS的碱性溶液即溶液Ⅱ裂解大肠杆菌细胞,变性蛋白质和染色体DNA,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段,碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状质粒DNA的两条链不会相互分开。
然后用溶液Ⅲ中和提取液的pH以使质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中,而线状染色体DNA片段难以复性,并与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起经离心沉淀,在溶液中只剩下质粒DNA和RNA。
溶液中的RNA可用RNA酶A降解,从而使溶液中仅仅留下质粒DNA。
DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理:
核酸分子是两性解离分子,DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在pH值为8.0-8.3时,核酸分子中碱基几乎不解离,而磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电场中向正极移动。
DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与DNA分子大小及构像有关,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
对于线形DNA分子,其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。
限制性内切酶反应的终止通常有以下三种方法:
1、采用65℃条件下温浴20min,通过加热失活内切酶;
2、加终止反应液(如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应;
3、通过电泳割胶回收或用酚/氯仿抽提,然后乙醇沉淀,此法最为有效且有利于下一步的DNA的操作。
限制性内切酶用量:
对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶,消化1-2小时。
但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-5倍,反应时间也要适当延长,但过分加大酶量,甘油会影响反应外,酶本身会导致识别序列的特异性下降,产生酶的星号活力。
限制性内切酶的星号活力及其产生原因:
限制性内切酶在非标准的反应条件下,能切割一些与其识别序列类似的序列,这种现象称星号活力。
每一种酶在特别的条件下均会产生这种活力。
星号活力的识别形式常对标准识别序列中两侧的碱基没有特异性。
产生星号活力的原因:
高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH(8.0)、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在
限制性内切酶酶切的限制性内切酶注意事项:
1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2.进行DNA酶切时,要在其最适温度下(大多数为37℃)进行,最好使用每一种酶的专用缓冲液。
当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时,如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好,则两种酶可同时切割。
3.限制性内切酶一定要低温下贮存(-20℃),以防止酶活性降低。
4.进行大量酶切时,先要确定限制性内切酶的浓度。
一般来说,要用2-3倍才能保证完全消化,对基因组DNA尤其如此。
5.琼脂糖凝胶的浓度直接影响DNA片段的分离效果,一定要根据被分离DNA片段的大小确定好合适的琼脂糖凝胶浓度。
6.EB是DNA的诱变剂具极强的致癌性,配制和使用过程中要特别小心,操作时要戴手套,有EB的废液和器皿要分别处理好。
7.大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃条件下结冰。
当最终反应液中甘油浓度大于5%时,某些限制酶的识别特异性降低,从而产生星活性,更高浓度的甘油会抑制酶活性。
因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影响。
8.反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大,小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散,并降低酶活性。
9.酶切反应所加入的酶量应适中,根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定,对不同的限制酶,各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
10.反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性。
11.酶切底物DNA应具备一定的纯度,其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚,大于10mM的EDTA,去污剂SDS以及过量的盐离子浓度,否则会不同程度地影响限制酶的活性。
12.反应取酶时必须使用新的无菌吸头,以免污染酶液,同时应尽量缩短酶在温室的放置时间,从冰箱中取出后,应置于冰上。
13.反应前的低速离心是必要的,这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
14.分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
15.不同厂家的试剂不可混用,需要时请查明相关条件及数据。
16.要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂,最后才加酶液。
取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾去过多的液体与酶
溴化乙锭染料检测核酸的原理:
在凝胶中加入少量荧光嵌入染料溴化乙锭(注意:
EB是强诱变剂!
),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种光络合物,在254-365nm波长紫外光照射下,呈现桔红色的荧光,因此可对分离的DNA进行检测,可以检出1-10ng的DNA条带,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
在电场中决定DNA的迁移速率的因素:
在电场中,在碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、DNA的分子大小
2、琼脂糖浓度
3、DNA分子的构象
4、电源电压
5、嵌入染料的存在
6、离子强度影响
离心机使用的注意事项
1、离心管一定要平衡好,离心管必须对称放入套管中,若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替
2、绝对不要超过离心机或转子的最高限转速
3、一定要在达到预设转速后,才能离开离心机;
若电动离心机如有噪音或机身振动等任何异状时,应立即切断电源停机,即时排除故障
4、通常听声音即可得知离心状况是否正常,也可注意离心机的震动情形
5、启动离心机时,应盖上离心机顶盖后,方可慢慢启动
6、在离心机停止转动后,方可打开离心机盖,取出样品,不可用外力强制其停止运动。
乙酸钾溶液的作用:
用高浓度低pH的乙酸钾溶液中和的作用是使质粒DNA复性,并沉淀大部分去污剂(十二烷基硫酸钾不溶于水)。
酚/氯仿抽提的目的:
用酚或酚-氯仿混合液抽提以去除碱裂解液中残余的蛋白质。
采用酚或酚-氯仿混合液对裂解液用进行抽提是经典的蛋白清除方法。
酚相与水相不相溶,当剧烈振荡然后静置或离心分相后,变性了的残余蛋白会沉降出来处于酚相与水相的界面。
溶解EDTA二钠盐时的关键是什么:
EDTA二钠盐只有当溶液pH用氢氧化钠调至8.0左右时才能溶解
核酸电泳时加样孔一侧靠近阴极(黑末端),
配制10%SDS溶液的主意事项:
10%SDS无须高压灭菌,SDS有毒,且微细晶粒易于扩散,故称量时要戴口罩,称量完后要清除在称量工作区和天平上的SDS
碱法提质粒的溶液Ⅰ中的葡萄糖的作用:
可以提高细菌悬浮液的渗透压,减少细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力
酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1体积比混合)的作用:
酚、氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
DNA片段纯化回收的原理:
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8ugDNA(70bp-10kb),回收率为60-85%。
琼脂糖凝胶在温和缓冲液(DE-A溶液)中溶解,其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解,然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上,经W1、W2溶液的洗涤清除蛋白和盐分,最后有pH洗脱液从膜上洗脱下来。
纯化的DNA可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
DNA片段纯化回收注意事项:
1.在步骤1中,将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间(线性DNA长时间暴露在高温条件下易水解),从而提高回收率。
勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下,减少紫外线对DNA造成的损伤。
2.步骤2中凝胶必须完全熔化,否则严重影响DNA回收率。
3.Eluent或去离子水加热至65℃,有利于提高洗脱效率。
4.DNA分子呈酸性,建议在2.5mMTris-HCl,pH8.5洗脱液中保存,减少DNA的脱氨反应。
5.尽量切除不含DNA的凝胶。
得到凝胶体积越小越好,不然影响回收率。
6.回收纯化的DNA片段一般在100bp到50kb之间,过长,过短片段的回收效率迅速降低。
7.使用前,BufferW1中加入等体积的无水乙醇
DNA连接的概念:
在一定条件下,由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。
DNA连接酶主要有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶,前者是T4噬菌体基因30编码的产物,后者是大肠杆菌基因组中lig基因编码的产物。
DNA连接酶作用机制:
DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。
反应过程可分三步:
(1)NAD或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物,同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸;
(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5‘-磷酸基端,形成一个焦磷酰衍生物,即DNA-腺苷酸;
(3)这个被激活的5'
-磷酰基端可以和DNA的3'
-OH端反应合成磷酸二酯键,同时释放出AMP。
10μl反应体系中加入T4DNA连接酶1μl(350U),温度16℃推荐过夜,通常在4℃过夜连接效果尚佳。
为什么PCR产物可与T载体连接:
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,能直接和T载体进行TA克隆。
蓝白斑筛选的机理:
载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。
E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。
在各自独立的情况下,载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。
但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
由α-互补产生的Lac+细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
在麦康凯培养基上,α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去α-互补能力,因而不产生β-半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。
基因带有相同的粘性末端的连接的策略:
用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化,亦得到同样的两个相同粘性末端。
在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有。
1)必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度,以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
2)可将载体DNA的5'
磷酸基团用碱性磷酸酯酶去除,最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'
端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连,产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E.coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
碱性磷酸酶(CIAP)在连接中的作用:
是一个二聚体蛋白,它是从线状DNA上去除5’磷酸基团,从而抑制质粒DNA的自身连接和环化。
基因连接的注意事项:
1.DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平末端,必须加大酶量,一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。
2.连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
3.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-20℃为好。
4.在连接反应中,如不对载体分子进行去5‘磷酸基处理,便用过量的外源DNA片段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。
转化:
将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。
DNA分子转化的原理:
吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面;
转入——双链DNA分子解链,单链DNA分子进入受体菌,另一链降解;
自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA;
表达——供体基因随同复制子同时复制,并被转录和翻译。
热击转化包括的主要步骤:
从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上;
加入连接产物,轻轻摇匀,冰上放置30分钟;
42℃水浴中热击60秒,热击后迅速置于冰上冷却5分钟;
向管中加入1mlLB液体培养基,混匀后37℃振荡培养1小时;
将上述菌液在6500rpm离心3分钟,剩余100μl上清,将沉淀混匀后涂布于含抗生素的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
感受态细胞:
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)
制备感受态细胞的关键:
受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,并应具有最佳的细胞生长状态和密度;
器具必须是非常洁净的,试剂均需是最高纯度的;
制备过程中保证菌体的有氧代谢;
控制细胞悬浮液中的各种离子;
制备感受态细胞过程中防治菌株被污染;
保存感受态时,使用冷冻保护剂,并采用液氮速冻感受态细胞;
要在冰上操作。
转化子:
带有异源DNA分子的受体细胞。
CaCl2法制备感受态细胞的原理:
是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子(即带有异源DNA分子的受体细胞)。
质粒转化的方法有哪几种:
热击转化法:
使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过42℃热击处理将载体DNA分子导入受体细胞。
电击转化法:
使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
提高转化率因素,即转化的注意事项:
1.细菌生长状态和密度
2.质粒的质量和浓度
3.试剂的质量
4.防治杂菌和杂DNA的污染
5.整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
卫星菌落:
有些载体带有β-内酰胺酶的基因,表达出β-内酰胺酶,它可以破坏氨卞青霉素。
当细菌培养时间过长,β-内酰胺酶积累过多,就会使氨卞青霉素失效,导致不含质粒的空菌落大量生长,这就是卫星菌落。
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是DNA基因在体外的一种扩增方法。
PCR的基本原理及三个步骤:
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理与体内相似,不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶,用合成的DNA引物替代RNA引物,用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制,反复进行变性、退火、延伸循环,就可使DNA无限扩增。
PCR具体分三个基本步骤:
(1)变性(Denature):
将PCR反应体系升温至94℃左右,目的双链的DNA模板就解开成两条单链,此过程为变性;
(2)退火(Anneal):
将温度降至引物的Km值以下(50℃左右),3'
端与5'
端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域通过氢键配对结合,此过程称为退火;
(3)延伸(Extension):
当将反应体系的温度升至70℃左右时,耐热的TaqDNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照于与模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'
端,形成新生的DNA链。
由这三个基本步骤组成一轮循环,每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
参与PCR反应体系的因素及其作用
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪:
1.引物:
PCR反应产物的特异性与长度由一对上下游引物,即5'
端引物与3'
端引物所决定。
5'
端引物是指与模板5'
端序列相同的寡核苷酸,3'
端引物是指与模板3'
端序列互补的寡核苷酸。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:
(1)引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,难以合成,且引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74度),亦会影响产物的特异性。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度:
Tm=4(G+C)+2(A+T)。
(3)四种碱基应随机分布,尤其在3'
端不应存在连续3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补,而影响PCR的特异性。
(4)引物3'
端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内,尤其在3'
端应不存在二级结构。
引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠,起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
(6)两引物之间尤其在3'
端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'
端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。
通常应在5'
端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。
引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,否则导致非特异性扩增。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'
端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
(10)引物3'
端是引发延伸的点。
因此不应错配。
由于ATCG引起错配有一定规律,以引物3'
端A影响最大,因此,尽量避免在引物3'
端第一位碱基是A。
引物3'
端也不要是编码密码子的第三个碱基,以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。
5’GTAGATGGACTTATGC3’CGTCCCGGTGACTCCTGGAATAATCGTCCATCCACTCTAAATCAGTTACGGCCTTATCCGCAGGAGTTGAAGTACAAAGGATGTATGATTCGAGGCTTACGGAGTAGAGATGTTCATTTTTCCAGCTTTCAATGGTCTCATGACACATGAGGGACTCGATGGGAAACTCAGGTGTGTAAGTGCTAACTGGGTCTGGGAATAGATGGCGTGCAGTGTAGTCGAAGTC3’
3’CGTCACATCAGCTTCAG5’反向引物,亦称下游引物
2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP):
dNTP为PCR反应的合成原料。
dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L,在此范围内,PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。
当dNTP终浓度大于50mmol
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