血脂各个项目的不同测定方法Word文档格式.docx
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目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据,然而血清样品中存在有游离甘油,如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油,多年来一直在研究讨论这一问题。
若不减去,其测定值将会高于血清样品中的真值,如果要减去,就必须先测出血清样品中的游离甘油,甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤,实际工作中难以做到。
有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07~0.13mmol/L,相当于甘油三酯的0.5~6.0mmol/L,为此建议,实测的甘油三酯量减去一个校正系数即:
甘油三酯(mmol/L)=[0.98×
总甘油(mmol/L)]-0.07(mmol/L)。
这一校正系数也仅适用于健康人,对临床病人并不一定适用。
据报道,血清样品的游离甘油一直是个未知数,无法测准。
为此,目前临床测定血清甘油三酯时,基本上未考虑游离甘油,因为其含量很少,暂且忽略不记。
甘油三酯测定的参考物,推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物(2:
1,W/W),此参考物适用于化学法。
在酶法测定中,仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。
3.磷脂测定
血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。
如需要分别检测各种磷脂,可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。
目前,临床仅测定血清磷脂总量。
血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。
化学法是以磷脂中的磷为定量依据,因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根,故将磷脂的磷称为脂性磷。
由于血清中磷脂大部分为卵磷脂,其分子量中磷约占4%,故将脂性磷换算成磷脂的系数,一般为25。
由于化学法均需要抽提,再测抽提液中的磷脂的磷,血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中,因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。
酶法是利用磷脂酶进行定量测定。
生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。
磷脂酶D特异性差,均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂,三者约占血清总磷脂的95%,临床多用含磷脂酶D的试剂进行磷脂的定量测定。
4.游离脂肪酸测定
游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸,故又称为非酯化脂肪酸,其量很少,采用方法必须是灵敏的方法,还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。
测定方法有:
①滴定法需要微量滴定装置,因为要通过肉眼观察颜色,难免会有主观因素的影响,所以难以测定准确,很难用于常规;
②光度法,以铜皂法常用;
③酶法,主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测,方法特异,快速准确,已常规应用于临床。
第一节胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,FC占30%。
CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。
血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。
血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1.化学法
化学法一般包括:
①抽提;
②皂化;
③毛地黄皂苷沉淀纯化;
④显色比色四个阶段。
代表性的方法有Sperry-Webb法,通过①~④步骤操作过程。
常规操作中多采用省去了②、③。
或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再经胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。
再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。
该法是目前常规的应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard显色反应,620nm比色定量。
该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组
成
贮存2~8℃
有效时间
R1
乙醇
优质纯
R2
石油醚
沸点68℃,特级纯
R3
水醋酸
分析纯
R4
无水醋酸
胆固醇分析用,不含HCI
R5
浓硫酸
R6
KOH液
33%(W/W)
KOH10g+H2O20ml
R7
乙醇性KOH液
R194ml+R66ml
临用前配制
R8
Liebermann
配制后
Burchard
R420体积+R51体积+R310体积
1h
试剂*
内用完
R9
胆固醇标准液
5.17mmol/L
胆固醇标准品200mg+R1→100ml
*:
在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。
3.操作
图15-1血清胆固醇(Abell法)测定操作图
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×
5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
组成
贮2~8℃
Na2HPO4
50mmol/L
Na2H2PO4
胆酸钠
3mmol/L
4-氨基安替比林
0.82mmol/L
R1*
ESPAS
14mmol/L
24h
Carbowax-6000
0.17mmol/L
CEH
33U/L
COD
117U/L
POD
6700U/L
标准液
用异丙醇溶解胆固醇
*混匀,调pH至6.70±
0.10(25℃),或购买试剂盒。
酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
A液:
CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液:
COD、4-氨基安替比林等。
图15-2血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项
目
参
数
方
法
终点法
波
长
双波长(540nm,700nm)
反应温度
37℃
试剂A反应时间
2~3min
试剂B反应时间
5~6min
样本用量
3μl
试剂A用量
250μl
试剂B用量
120μl
单位
mmol/L
3.操作过程
以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。
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