组织工程实验讲义Word下载.docx

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6．参考兄弟院校相关专业的实验课程开设情况。

通过本实验课的教学实践，使学生加深理解理论课学习的内容，掌握组织工程基本的实验技术和操作规程，达到独立开展组织工程实验的能力。

本《组织工程实验》讲义是由生物工程综合教研室和生物工程实验中心全体教师共同努力完成的。

由于编写时间仓促，编者水平有限，教学经验不足，对于文中存在的错误和纰漏之处，恳请各位老师和同学批评斧正。

2005年11月

目录

实验一骨髓间充质干细胞的分离培养………………………4

实验二软骨细胞的分离培养…………………………………7

实验三大鼠神经胶质细胞的分离培养………………………11

实验四鼠尾胶原的制备………………………………………16

实验五胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平检测…………18

实验一骨髓间充质干细胞的分离培养

【实验目的】

1．掌握骨髓取材的基本方法。

2．掌握分离骨髓间充质干细胞（MSC）的方法。

【实验原理】

利用密度梯度离心法，将骨髓中的各种细胞分层，分离出骨髓间充质干细胞。

【实验材料】

1．动物：

4周龄新西兰大白兔。

2．实验器械：

手术剪刀（直、弯）、手术镊子（直、弯）、手术刀柄及刀片、穿刺针等常规手术器械。

3．戊巴比妥钠（3%）：

戊巴比妥钠3g，溶于100ml生理盐水中，搅拌10min左右，室温保存。

4．Percoll（Pharmacia）分离液的制备：

取Percoll原液9份，加入1份1.5mol/L的NaCl为贮存液，可置于4℃保存。

分离时取贮存液0.56份，加入0.44份0.15mol/L的NaCl备用，密度为1.073g/ml。

5．MSC培养液的组成：

含有10%胎牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100μg/ml青霉素钠、100U/ml硫酸链霉素的低糖DMEM培养液。

6．无Ca2+、Mg2+磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：

NaCl0.8g、KCl0.2g、Na2HPO4•12H2O2.9g、KH2PO40.2g，二次蒸馏水溶解，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。

高压灭菌后，4℃冰箱保存。

7．白细胞稀释液的组成：

无水乙酸2ml，1%龙胆紫1ml，蒸馏水97ml，混匀备用。

8．苔盼蓝（0.4%）：

苔盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水中，搅拌10min左右，过滤，室温保存。

【实验步骤】

1．抽取骨髓：

3%戊巴比妥钠按50mg/kg体重的剂量行兔腹腔注射麻醉。

无菌条件下，暴露左右两侧胫骨表面的近中端。

用一支固定有18号针头内含0.1ml肝素（3000U/ml）的5ml注射器从骨髓中抽取2ml骨髓液。

2．将采集到的抗凝骨髓经低糖的DMEM稀释1～2倍，离心（900g，10min）。

将含有脂肪的上清液吸去。

再取与弃去培养液等量的低糖DMEM重悬骨髓细胞，调整有核细胞数为（1×

107～2×

107）/ml。

3．取Percoll工作液4～5ml，放入15ml离心管中。

4．用吸管吸取稀释骨髓液，在离分层液约2cm处，沿管壁缓缓加入，使稀释骨髓液与分层液的比例为1：

1。

5．离心（900g，30min）后内容物分三层：

上层为血小板，中间层为分离液，底层为红细胞和多核白细胞。

在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。

6．吸管轻轻插到云雾状的白膜层，沿管壁周缘吸取界面层的单个核细胞，移入另一管中。

7．用5倍以上体积的低糖DMEM稀释，混匀后，离心（900g，10min）。

细胞重悬后再次洗涤。

8．末次离心后，吸尽上清，加入少量的含有10%胎牛血清的低糖DMEM。

取1滴细胞悬液，以白细胞稀释液1:

20倍稀释计数，然后将细胞浓度调节至1.0×

106/ml。

9．细胞活力检测：

取1滴细胞悬液加1滴苔盼蓝混匀，加至计数板内，高倍镜下镜检，活细胞为折光性良好的不着色细胞，死细胞被染成蓝色，胞体略膨大。

10．将单个核细胞按2.0×

105/cm2的密度接种于培养瓶内。

37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。

11．48小时后，有少量细胞贴壁，呈纺锤形。

吸去上清，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞表面3次，将未贴壁细胞弃去。

12．7天左右出现克隆，14天出现致密贴壁细胞层。

13．弃去上清，用PBS洗一次，0.05%胰蛋白酶消化至细胞呈圆形，加含有血清的培养液终止消化。

计数细胞，按6.0×

103细胞/cm2传代。

【结果观察】

在倒置显微镜下观察，原代和传代培养的人MSC均呈现成纤维细胞样形态，细胞排列成束。

【思考题】

在本实验中，对Percoll分离液有何要求？

实验二软骨细胞的分离培养

掌握软骨细胞体外分离、培养的基本方法。

关节软骨包含有高度发达的细胞外基质（主要为Ⅱ型胶原、蛋白多糖）和相对稀疏、特化的细胞群（关节软骨细胞），细胞占总软骨体积小于5%。

根据关节软骨的这种构成特点，关节软骨的分离主要依赖于Ⅱ型胶原酶，该酶具有较强梭状芽胞杆菌酶活性，适用于软骨、心肌、骨、肌组织、甲状腺和肝脏组织的消化。

1．实验动物：

4周龄新西兰白兔。

2．手术器械：

平头弯剪刀、手术刀柄及刀片、大钩镊、眼科剪。

3．实验器皿：

玻璃平皿、吸量管、玻璃培养瓶、50ml离心管、孔径45μm尼龙纱网、24孔培养板。

4．实验试剂：

脱毛液、碘棉、75%乙醇、D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶、0.02%Ⅱ型胶原酶。

D-Hanks溶液的配制：

准确称取NaCl0.8g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H2O0.716g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，溶解于三次蒸馏水中，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。

高压灭菌后，于超净台内加入滤过除菌的青霉素、硫酸链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100μg/ml。

4℃冰箱保存待用。

DMEM培养液的配制：

按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制。

内含10%新生牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100μg/ml青霉素钠、100U/ml硫酸链霉素，调pH=7.0～7.2，过滤除菌，分装，-20℃贮存备用。

胰蛋白酶消化液的配制：

用D-Hanks溶液将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌后，-20℃贮存备用。

0.02%Ⅱ型胶原酶的配制：

用低血清（3%）DMEM培养液将Ⅱ型胶原酶配成浓度为0.02%的工作液，过滤除菌后，-20℃贮存备用。

5．实验设备：

超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、台式离心机、恒温摇床、电子分析天平、酸度计等。

1．取材：

1）将死亡4小时以内的新西兰白兔置于手术托盘中，两侧膝关节进行脱毛处理后，将其移入超净工作台内。

2）无菌条件下用碘酊仔细消毒膝关节皮肤，手术刀切开皮肤、皮下肌膜，深切入关节囊，暴露骨髁和胫骨面，横切开前十字韧带，将两侧股骨远端的关节软骨完全暴露。

3）切下全部关节软骨，去掉中间的骨化部分，收集于含有D-Hanks溶液的培养皿中。

2．机械分离：

1）剪切兔关节软骨成1～3mm3的小碎块。

2）将软骨碎块移入50ml培养瓶中，加入10mlD-Hanks溶液漂洗软骨碎块，静置片刻后吸弃上清，再加入新鲜D-Hanks溶液。

如此反复将软骨碎块洗涤二次。

3．酶分离：

1）将经过洗涤的软骨碎块悬浮于软骨体积10～20倍的0.25%胰蛋白酶消化液中，37℃轻微摇动下保温2小时。

静置后吸弃胰蛋白酶溶液，D-Hanks漂洗软骨碎块三次。

2）软骨碎块再重新悬浮于软骨体积10～20倍的0.02%的胶原酶消化液中，37℃消化过夜。

镜下观察培养液中有游离单个细胞时，终止消化。

用吸量管轻微吹打，将细胞分散形成细胞悬液。

4．尼龙纱网过滤：

1）将分离的细胞悬液通过孔径为45μm的尼龙网滤器，收集滤液。

2）滤液离心（1500rpm，5min），弃上清。

3）细胞沉淀用含10%新生牛血清的DMEM培养液悬浮，同上述方法离心洗涤，重复操作三次。

5．细胞计数，接种培养：

离心管内的细胞沉淀用1ml含10%小牛血清的培养液悬浮（定量），用血球计数板计数细胞，调节细胞密度至105-106/ml，接种于培养皿中。

将培养皿置于37℃、5％C02、95%空气气相饱和湿度的培养箱中培养。

隔日换液。

1．在倒置相差显微镜下观察，刚接种的软骨细胞为球形，4小时左右开始贴壁生长。

如果24小时以内细胞在培养皿中不贴壁，提示分离的细胞活力不佳或者可能发生了污染。

培养7-10天，原代单层培养的软骨细胞汇合成片，呈圆形或椭圆形，可分泌少量细胞外基质。

传代后，细胞变为多角形，细胞外基质增多，具有折光性。

2．软骨细胞的反分化现象：

单层培养的软骨细胞传代后失去原有形态，出现所谓的成纤维细胞样变。

表现为：

正常球形软骨细胞随着不断传代，转变成梭形和成纤维细胞形。

细胞形态发生改变的同时，其功能也发生一系列变化如：

蛋白多糖（PGs）的合成、分泌减少，硫酸化程度降低；

软骨细胞的标记性蛋白——Ⅱ型胶原蛋白的合成减少，代之以Ⅰ型胶原蛋白的合成。

因此，若想长期保持软骨细胞特性，软骨细胞在单层培养中，传代不能超过四次。

软骨细胞分离的关键步骤是什么？

采用何种培养方式能够长期维持软骨细胞的表型？

实验三大鼠神经胶质细胞的分离培养

1．掌握脑组织取材的基本方法。

2．掌握神经胶质细胞体外培养的基本方法。

采用机械分离与胰蛋白酶消化的方法，分离出大脑神经胶质细胞。

依据如下三方面特征，对大脑灰质组织中的星形胶质细胞和少突胶质细胞进行进一步的分离培养：

1．星形胶质细胞的增殖速度远大于少突胶质细胞和其它神经细胞；

2．星形胶质细胞与其它神经细胞将分层生长，星形胶质细胞在底层，其它细胞一般生长在星形胶质细胞层之上；

3．分层生长的细胞以一定力度摇动处理，可选择性地使在星形胶质细胞层上生长的细胞脱壁。

出生后1周以内的大白鼠。

眼科剪刀（直、弯）、眼科镊子（直、弯）、手术剪刀、手术刀柄及刀片等常规手术器械。

玻璃培养皿、吸量管、离心管、尼龙滤网（75μm）、培养瓶、细胞计数板、细胞计数器、微量移液器、小滤器。

4．培养用液：

①.无Ca2+、Mg2+的Hanks液（CMF-Hanks）：

准确称取0.4gKCl、0.06gKH2PO4、8.0gNaCl、0.35gNaHCO3、0.08gNa2HPO4·

12H2O溶解于1000ml双蒸水中，内含100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，调 

pH=7.2，灭菌待用。

②.胰蛋白酶消化液：

用CMF-Hanks将胰蛋白酶配成浓度为0.125%的工作液，过滤除菌。

③.DMEM／F12（1:

1）培养液：

按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制，内含20%的新生牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，调pH=7.2～7.4，过滤除菌，分装，-20℃贮存，备用。

1．大鼠大脑神经胶质细胞的分离培养（原代培养）

（1）.取出生1周以内的新生大白鼠，用碘酒、酒精棉球消毒，无菌环境下（以下各部操作均在无菌条件下进行），断头取其大脑皮层组织。

（2）.解剖显微镜下，剥离脑膜，切除大脑髓质部分。

（3）.将大脑皮质在CMF-Hanks液中剪碎。

（4）.室温下静置10min。

（5）.用0.125%的胰蛋白酶在37℃下消化30min。

（6）.加入少许含有血清的DMEM/F12（1:

1）混合培养液，用吸管稍加吹打至胰蛋白酶与培养液混匀，以终止消化。

1000r/min下离心5min。

（7）.吸弃上清含酶液体，重新加入含有血清的DMEM/F12培养液，用吸管反复吹打至组织块消散为止，制备细胞悬液（初细胞悬液）。

（8）.将初细胞悬液接种到玻璃培养瓶中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育30min。

（9）.翻转培养瓶，吸出瓶中的细胞悬液，并用75μm滤网过滤。

（10）.将滤过液离心（1000r/min，10min），吸弃上清液。

加入3ml上述含血清的培养液，用吸管轻轻吹散细胞团，制成单细胞悬液（次细胞悬液）。

（11）.细胞计数，调节细胞密度。

（12）.将次细胞悬液以1.0×

104个细胞/cm2的细胞密度，种植到预先涂布有鼠尾胶原的培养瓶中。

（13）.于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，隔日换液。

2．星形胶质细胞与少突胶质细胞的分离培养

分离的大鼠大脑皮质细胞在原代培养4小时后，部分细胞即可长出细小胞突。

培养3～4天之后，细胞数量便明显增多。

随着培养时间的延长，培养物中星形胶质细胞的比例越来越大，而其它细胞成分的比例越来越小。

大鼠大脑胶质细胞原代培养一般在9～14天，以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁。

而少突胶质细胞生长在星形胶质细胞层上。

传代之后，星形胶质细胞的比例更高。

体外培养的星形胶质细胞胞体较大、很扁、形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有1～2个核仁。

星形胶质细胞的胞突较多较长。

可用抗GFAP抗体、免疫细胞化学染色进一步鉴定星形胶质细胞。

1．分离不同胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）的关键步骤是什么?

2．在分离胶质细胞实验中，如何除去成纤维细胞的污染？

实验四鼠尾胶原的制备

1．掌握天然细胞外基质——胶原的制备方法；

2．掌握胶原的提纯方法。

胶原蛋白存在于机体内各种组织和器官中，通常从富含胶原纤维的组织，如皮肤、肌腱、骨骼中提取。

从动物中提取的胶原具有与人体胶原相近的氨基酸序列，因而人体对其具有很低的排斥性。

由于胶原分子内和分子间较强的相互作用，胶原纤维既不溶于水，也不溶于有机溶剂；

但刚生成的胶原胶联程度较低，可部分溶于水。

根据胶原的溶解特性，其制备方法可分两类：

一是通过溶解掉组织中可溶的胶原和非胶原成分，得到胶原纤维。

这种方法所需时间较长，但能保留组织中的大部分胶原，适合工业化的规模生产；

另一种是分离和提纯可溶的胶原分子。

这种方法对原材料要求较高，但能得到纯度高的胶原，适合实验室中的少量制备。

本实验选用第二种方法，即用稀的有机酸溶液（0.1%乙酸）溶解和提取出没有交联的胶原分子，有选择地从成年大白鼠尾腱中提取出较纯的胶原蛋白。

成年大鼠鼠尾。

眼科剪刀（直）、眼科镊子（直、弯）、手术剪刀、手术刀柄及刀片等常规手术器械。

玻璃培养皿、吸量管、离心管、150ml烧杯、250ml玻璃瓶。

4．实验用液：

①.PBS：

0.2gKCl、0.2gKH2PO4、8gNaCl、2.892gNa2HPO4•12H2O溶于950ml双蒸水中，调pH至7.0～7.2，补加双蒸水至1000ml。

②.稀乙酸：

以蒸馏水按1:

1000稀释

③.70％乙醇

④．NaOH（0.1mol/L）：

称取0.4gNaOH加入90ml三蒸水中，溶解后补加蒸馏水至100ml

⑤．去离子水

低温高速离心机、普通冰箱

1．取成年大鼠鼠尾，去除尾上皮肤，将肌腱与肌肉及其它组织分开；

2．将肌腱在70％乙醇中浸泡20min，切碎，用去离子水冲洗；

3．转移至稀乙酸（1：

1000）溶液中，每根鼠尾用250ml乙酸溶液，4℃保持48h；

4．4000r/min离心30min，取上清；

5．加入0.1mol/LNaOH，按6：

1体积比混合，中和乙酸，1500r/min离心5min获取沉淀；

6．等体积稀乙酸（1：

1000）溶解沉淀，4℃保存。

可见肌腱在弱酸性溶液中因吸水明显膨胀，溶液变得粘稠。

胶原提纯的方法有哪几种？

实验五胶质纤维酸性蛋白（GFAP）

表达水平检测

1．掌握免疫细胞化学染色的基本方法；

2．了解其它免疫标记技术的基本原理。

免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）与免疫组织化学（immuno-histochemistry，IHC）是组织工程学常用的实验技术，用于种子细胞的表型、纯度分析及组织工程化组织的组织类型鉴定等。

本研究中采用免疫细胞化学技术检测人星型胶质细胞瘤中纤丝神经胶质细胞酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）表达水平。

免疫细胞化学技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，以标记抗体为探针来显示细胞表面或细胞内抗原成分，主要是多肽与蛋白质，对其进行定位、定性及定量的研究。

常用免疫细胞化学技术原理包括：

间接法、PAP（peroxidase-antiperoxidase）法、标记链亲和素-生物素法（labeledstreptoavidin，LSAB法）、葡萄球菌蛋白A法（staphylococalproteinA，SPA法）等。

免疫细胞化学技术常用的显色标记物：

辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、荧光素（fluorescein）、胶体金（colloidgold）等。

星型胶质细胞胞体和胞突内含有大量的胶质丝，为GFAP的多聚体。

GFAP是星型胶质细胞所特有的细胞骨架蛋白，经免疫组化证实，它是星型胶质细胞及其肿瘤的特异标记物。

1．人星型胶质细胞瘤细胞系U251；

2．实验器皿：

吸量管、离心管、细胞计数板、细胞计数器、微量移液器、载波片、盖玻片、片架、湿盒、吸水滤纸。

3．实验用液：

①.胰蛋白酶消化液：

用PBS将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌。

②.DMEM／F12（1:

按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制，内含10%的新生牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，调pH=7.2～7.4，过滤除菌，分装，-20℃贮存，备用。

③.PBS：

④.多聚赖氨酸（0.05mg/ml）：

称取0.5mg多聚赖氨酸加入9ml蒸馏水，溶解后补加蒸馏水至10ml。

⑤.0.5%TritonX-100：

以PBS将Triton-100配成浓度为0.5%的工作液，贮存备用。

⑥．丙酮

⑦．一抗：

兔抗GFAP（ZYMEDLABORATORIESINC，USA）

⑧．免疫组化染色试剂盒（SP-9000）：

内含：

3％H2O2－去离子水，封闭用正常山羊血清工作液，生物素标记山羊抗兔IgG

⑨．DAB试剂盒：

浓缩缓冲液（20×

），DAB溶液（20×

），浓缩过氧化氢溶液（20×

）

倒置相差显微镜、台式离心机、电子分析天平、酸度计等。

1．以多聚赖氨酸处理载玻片，自然干燥；

2．以0.25％胰蛋白酶消化细胞，镜下观察有游离单细胞时加入含血清的培养液终止消化。

3.PBS洗涤（1500r/min，5min）3次，调细胞浓度为2×

105/ml，滴片；

4．丙酮固定10min，用PBS洗2次；

5．以100μl0.5%TritonX-100处理标本2次，各5min；

6．加30μl过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育20min，PBS洗2次；

7．加30μl的非免疫性动物血清（羊血清），室温下孵育30min，倒掉，勿洗；

8．加30μl一抗（以PBS1：

100稀释），室温下孵育60min，PBS洗3次，每次3min；

同时以1：

1000稀释的正常兔血清（PBS稀释）作为阴性对照；

9．加30μl生物素标记的羊抗小鼠IgG，室温下孵育20minPBS洗3次，每次3min；

10．加30μl链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育20min，PBS洗3次，每次3min；

11．加100μl新鲜配制的H2O2-DAB溶液，避光5min，自来水冲洗终止反应，加盖玻片，镜下观察结果。

显微镜下观察可见胶质细胞胞浆呈咖啡色或棕褐色。

试举例说明免疫细胞化学法在种子细胞表型鉴定上的作用。