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②对已知突变进行分析,即在临床上对致病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。
在实际应用中许多检测未知突变的方法也可用来对已知突变进行检测。
1对未知突变进行分析的方法
1.1化学切割错配(chemicalcleavageofmismatch,CCM)
化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变【1】。
只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达100%;
使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。
该方法的最大优点是能对长至2kb的片段进行分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。
1.2单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism,SSCP)
该方法的原理是【2】:
单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使是一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。
由于SSCP法简单快速,因而被广泛应用于未知基因的突变分析和临床检测。
该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变,由各实验室报导的突变检出率从99%到35%不等。
由于随DNA片段大小的增加,迁移率的改变明显减小,故而该方法只适合用来检测150~200bp的DNA片段。
一般来说对小于200bp的片段其检出率可达90%,而对大至400bp的片段,其检出率可能只有70%~80%。
同时该方法要求多次摸索条件,如电泳温度,胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。
至于突变类型,除G到T的置换外,似乎对其检测的灵敏度并无大的影响,此外,该方法不能确定突变的精确位置。
尽管如此,由于SSCP的使用简单便利,科研工作者在应用中对其进行了不断地改进,这些改进包括:
优化电泳条件,多重PCR的使用,对较大片段的PCR产物先进行酶切消化再跑电泳,毛细管电泳取代普通胶电泳以及自动测序仪的使用等。
尽管这些改进增加了该方法的复杂度和花费,但却使SSCP的检出率大大提高,接近于100%。
此外,使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度,尤其是对大于200pb的片段。
1.3RNA酶A切割(RnaseAcleavage)
在一定条件下,异源双链核酸分子RNA:
RNA或RNA:
DNA中的错配碱基可RNaseA切割,切割产物可通过跑变性胶得到分离。
RNA探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到,当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时,RNaseA在错配处的切割效率很低甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。
所以如果仅分析被检DNA的一条链,其突变检出率只有30%,而如果同时分析被检DNA的正义链和反义链,则有效率可达到70%【3】。
尽管RNaseA切割法有其局限性,如需使用同位素,需将PCR产物克隆至表达载体上,从而增加了操作的复杂度,但由于它能对1~2kb的片段进行检测,并能确定突变位置,且无需使用有害化学试剂,故仍被频繁使用。
1.4DNA芯片技术(DNAchip)
DNA芯片技术是90年代以来发展起来的一项新技术,该技术结合了集成电路计算机、半导体、激光共聚集扫描,荧光标记探针和寡核苷酸DNA合成等技术,充分体现了生物学技术与其它重要的作用,如基因定位,DNA测序,物理图谱和遗传图谱的构建等,同样,在基因突变检测方法,DNA芯片技术的前景也令人鼓舞【4】,其基本原理是:
许多已知顺序的寡核苷酸DNA被排列在一块集成电路板上,彼此之间重叠一个碱基,并覆盖整个所需检测的基因,荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交,由于至少存在一个碱基的差异,正常DNA和突变DNA将会得到不同的杂交图谱,通过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变。
该方法简单、迅速、自动化程度高,虽然还有许多理论上的问题,但具有很大的发展潜力,1996年7月,第一块有关HIV酶的DNA芯片问世,相信随着技术的进一步改进,该方法在突变检测中将会发挥越来越重要的作用。
1.5蛋白截短测试(ProteinTruncationTest,PTT)
与一般的基因突变检测技术不同,该方法主要是从蛋白质水平上来检测基因突变,而且主要检测由于碱基的缺失或插入导致了开放阅读框架改变的突变,其基本原理是【5】:
抽提正常人和病人的mRNA,将所需检测基因反转录成cDNA,反转录所用的引物含有一段T7启动子和真核细胞翻译起始顺序,PCR产物经反转录后在无细胞提取液(如免网织红细胞裂解液)中能被翻译而合成蛋白质,由于病人中的突变导致了开放阅读框架的改变,因此,当所合成的蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶检测时,病人会出现比正常蛋白质增长或截短的蛋白产物。
该方法的优点是突变检出率高,可达100%,一次可处理大量的样品,并可检出长达4~5kb片段中的突变,但需要抽提组织的mRNA,且不能检测没有导致开放阅读框架改变的突变,如氨基酸置换等,另外移码突变如果太靠近基因的5′端或3′端,用聚丙烯酰胺凝胶电泳也无法检测出,由差异剪切所形成的异构体也会影响结果的分析【6】。
目前Promega公司已生产了进行这方面工作的产品,并且成功的利用该系统对APC、BRCAI抑瘤基因和NF1基因的已知突变进行了检测。
1.6切割片段长度多态性(CleavageFragmentLengthPolymorphismCFLP)
CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术,其原理是:
双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而CleavaseI外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱【7】。
目前已有厂家生产了专门的试剂盒来进行这方面的工作,BoehringerMannheim(BM)公司提供的CFLPScankit。
从理论上来说,该方法比较简单,能同时处理大量的样品,灵敏度也比SSCP高,但MaddoxLO等通过检测Iduronate2-sulfatase(IDS)基因第八外显子中已知的六种突变,发现SSCP技术能检测到全部的六种突变,而CFLP技术仅能检测到六种突变中的三种。
1.7错配接合蛋白检测(MutationDetectionbyMismatchBindingProteins)
从Ecoli中分离的一种DNA错配接合蛋白能在异源杂合双链DNA中的错配碱基处接合DNA,接合后的产物跑测序胶,可通过电泳迁移率的改变检测是否有突变【8】。
该方法的优点是操作简单,可一次处理大量的样品,但据报道这种DNA错配接合蛋白对单碱基错配的接合程度不如对几个碱基错配的接合那么强,并且这种蛋白对非错配区也有一定的结合从而导致背景增高,最近有研究工作者建议将几种DNA错配接合蛋白联合起来使用将会提高突变检测的准确率,但总的来说该方法有待于进一步发展。
1.8变性的高效液相色谱检测(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)
DHPLC技术是一项在SSCP和变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoreris)DGGE基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术,其原理与DGE类似,即通过HPLC在部分变性的条件下可将发生错配的异源杂合双链DNA和完全匹配的同源双链DNA分离开来【9】。
DHPLC技术曾被用来进行比较DNA测序,目前在Stanford的一个研究小组正在利用该技术检测与疾病相关的基因突变。
与传统的杂合双链分析技术相比较,该技术花时短,分析一个样品一般仅需5分钟,不需使用放射性同位素,自动化程度高,但是需要另处购买一台HPLC仪器。
虽然目前该技术主要用来检测200~300bp大小的DNA片段,长的DNA片段的检测尚未见报道,但研究工作者对此持乐观态度。
1.9变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoreris,DGGE)
该方法的原理是:
双链DNA分子在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时,会在一定的时间发生部分解链,导致电泳迁移率下降,当正常的DNA分子和发生突主的DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异时,也会在不同时间发生部分解链,从而被分离成两条带。
为了提高检出率,还可将突变的DNA和正常人的DNA混合变性再变性,然后再在上述条件下电泳,则会形成四条带,即突变的DNA分子,正常的DNA分子和两种发生错配的DNA分子,检测某种突变所需的特定的变性剂浓度可通过变性梯度凝胶电泳来确定【10】。
在两个同源双链DNA分子间有一个碱基对不同时,其Tm值就相差1℃或更高,有一个碱基错配的异源双链DNA分子与同源双链DNA分子比较,其Tm值可相差6℃以上,由于其Tm值不同,这些有一个碱基错配或一个碱基对不同的双链DNA分子中发生突变的区域就会在不同的时间发生解链,从而被分离。
利用DGGE技术检测突变时应考虑的一个问题是当突变发生在高熔点区时则难以检测到突变,原因有二个:
①随着熔解区域(Tm值不同)的增加,迁移率的变化减少,难以将正常DNA分子和突变DNA分子分开,而当整个DNA分子完全解链时,其迁移率只取决于单链的长短;
②突变区域发生解链需要较长时间,故检测所需的时间较长。
为了检测到所有可能的突变,在进行DGGE之前将所需检测片段的序列输入计算机,利用相应软件(如Bio-Rad公司的MacMeltSoftware)进行分析,如发现突变位于高熔点区,则最好在一个PCR引物的5′末端加上一段约40~50bp的GC夹,但如果突变发生在GC富集区(如CpG岛),仍难以检测到,同时,该方法对肿瘤的突变检测有困难,尤其是对实体瘤,且该法不能确定突变位置。
该方法的优点是如果突变发生在最先解链的DNA区域,则其检出率可达到100%,其检测的片段可达1kb,尤其适于100~500bp的片段。
1.10DNA测序(Sequencing)
由各种突变检测技术检测到的突变最后都得由测序来确定突变类型及突变位置,而且测序法检测突变的效率达到100%,基于此,有科研工作者提出对一些比较小,外显子比较少的基因的突变检测直接用测序来进行,如CMTX的CX32基因的突变分析【11】,但该方法需要较多的劳力,且需接触同位素,由PEABD公司推出的DNA自动测序仪使用四色荧光标记代替了原来手工测序的同位素标记,并且测序和分析数据的时间也大大缩短,但缺点是花费昂贵,所以对一些较大的,外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变,同时也不适用于临床对大量的标本进行检测,此外,测序也不能被当成是突变检测的金标准,杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。
2对已知突变进行检测的方法
2.1限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis)
当突变影响到某一限制性内切酶酶切位点时,可简单地通过酶切病人的PCR产物继而跑胶电泳来检测是否有突变;
如果突变没有影响到限制性内切酶的酶切位点,也可通过在PCR的引物中导入限制性内切酶位点来检测突变。
该方法的最大改进是一种叫做“突变等位基因富集PCR”技术的出现【12】,即:
首先用靠近突变碱基且导入了限制性内切酶消化后再用同样的引物扩增,由于突变的DNA不会被限制性内切酶消化,因而第二轮PCR只有突变DNA被扩增,利用这种方法可检测出106细胞中一个突变细胞的存在。
2.2等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)
这是一项基于杂交的突变检测技术,设计一段15~20bp的寡核苷酸片段,其中包含了发生突变的位点,当与固定在膜上的样品DNA(如PCR产物)杂交时,由于在20bp中一个碱基的差异会导致Tm值下降5~7.5℃,因此通过严格控制杂交条件,可鉴定出样品DNA中是否存在突变【13】。
为了同时检测多种突变或多态,也可将各种寡核苷酸片段固定在膜上,然后用样品DNA来杂交,这种方法称之为反向点杂交技术。
杂交反应还可在溶液中进行,荧光免疫检测系统可用来代替杂交中的放射性同位素,该方法是最老的检测已知突变的方法,几乎所有的已知突变均可用该法来检测,并且目前最新的一项DNA分析技术,即DNA芯片技术,就是根据ASO的原理而设计的,该法的主要缺点是需要优化杂交条件以避免假阳性或假阴性。
2.3寡核苷酸连接检测(OligonucleotideLigationAssay,OLA)
该方法的原理是【14】:
两个引物与样品DNA的同一条链退火,其中可能的突变位于5′引物的3′末端,这两个引物中的5′引物的3′端紧邻3′引物的5′端,当5′引物的3′末端碱基与样品DNA互补时,连接酶就可将这两个引物连接起来,通过多次重复变性和连接步骤,最后电泳检测是否有连接产物的产生以区别突变的DNA和正常DNA,最近有研究工作者提出一种策略,使该方法进一步自动化,即在5′引物的5′端连上生物素,在3′引物的3′端连上地高辛,杂交和连接反应后,用链霉亲和素吸附,然后用抗地高辛的抗体来检测链霉亲和素的捕获产物是否含地高辛。
OLA法的成功主要取决于连接反应的条件优化,如连接反应体系中盐的浓度及连接酶和DNA的比例等。
2.4等位基因特异性扩增(Allele-SpecificAmplification,ASA)
该法通过设计两个5′端引物,一个与正常DNA互补,一个与突变DNA互补,对于纯合性突变,分别加入这两种引物及3′端引物进行两个平行PCR,只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸得到PCR产物;
对于杂合性突变则需定量分析。
如果错配位于引物的3′末端导致PCR不能延伸,则叫“ARMS”(AmplificationRefractoryMutationSystem)
【15】,如果错配位于引物之间而影响引物退火,则叫“COP”(CompetitiveOligonucleotidePriming)或“CCA”(ColorComplemetationAssay)。
该方法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有错配时的错配延伸,这可通过调整实验条件如引物、靶DNA、TaqDNA聚合酶的浓度等来提高反应的特异性,在反应体系中加入甲酰胺亦可减少非特异性扩增。
此外,还可通过人为地使引物3′末端的第二个碱基发生错配来阻止错误延伸。
2.5引物延伸检测(PrimerExtension,PEX)
PEX的原理与ASA相似,通过设计一个引物,其3′末端紧邻已知的突变碱基,当反应体系中加入一种与靶DNA上紧靠引物3′末端的碱基互补的标记核苷酸时,这种被标记的核苷酸才能连接上去,从而形成一条带标记的寡核苷酸链,而如果所加的标记核苷酸与引物3′末端相邻的碱基不互补时,则不会发生延伸反应,通过电泳可将这两种情况区别开来,这种方法也被称为“微型测序法”【16】,该法还可和双脱氧测序法相结合使用,如果引入固本技术,还可以不通过电泳就可检测到是否有突变,并且有利于自动化。
3毛细管电泳在突变检测中的应用
以上所介绍的各种方法绝大多数都需要利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙酰胺凝胶电泳来分离野生型DNA分子及突变DNA分子,虽然琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳简单且不需贵重的仪器,但它们费时、费力,并且不适合于自动化的要求。
毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)最初出现是在1981年【17】,主要用来分析蛋白质,多糖和DNA。
在CE上有两套检测系统可用来对DNA进行检测,即紫外检测系统(UA)和激光诱发的荧光检测系统(LIF)。
由于LIF系统的灵敏度较UV高100倍,因此对微量DNA的检测人位更倾向于利用LIF。
利用CE进行DNA分析时最主要的优点是快速,微量、分辨率高,重复性好,易于定量和自动化。
据报道,CE能在20分钟之内分离长至几个kb的DNA片段,对于外显子大小的DNA片段,其分辨率可达到1bp。
对DNA进行分析的CE通常为以凝胶为介质的毛细管凝胶电泳以及在此基础上发展起来的ESCE(Entangled-SolutionCapillaryElectrophoresis)。
由于毛细管电泳具有上述的各项优点,因此该项技术目前已被广泛地应用于细菌、病毒基因的鉴定,核酸定量,基因突变的检测等。
在突变检测方法毛细管电泳主要是和其它突变检测的技术相结合,用毛细管电泳代替传统的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.1检测未知突变
毛细管电泳可与杂合双链分析,SSCP分析,DGGE,ddF等技术相结合,从而使突变检测的时间缩短,并大大提高了检测的灵敏度。
以SSCP为例,当对一个外显子大小的DNA片段用传统的SSCP方法分析时,需耗时20小时,并且要严格控制电泳的温度,而利用CE分析仅需11~25分钟,并且在1个小时内能同时分析几百个样品,分析结果可非常直观地即时显现出来,特别是多色荧光检测系统的使用更使检测的灵敏度大大提高,对于筛选突变瘤中检微量的突变细胞,CE也能够胜任。
对于某些疾病,突变等位基因的活性与疾病的发生直接相关,利用传统的方法须进行定量逆转录PCR,如光密度扫描和放射自显影,这些技术耗时、费力,而利用CE来进行这方面的工作,不需特异性标记探针,还可同时做PCR条件的优化。
3.2检测已知突变
毛细管电泳可与PCR-RFLP,寡核苷酸连接检测(OLA),等位基因特异性扩增(ASA),ARMS,STR-PCR等相结合,其最主要的优点也是增大录敏度,减少分析时间,以等位基因特异性扩增为例,用聚丙烯酰胺凝胶电泳对DMD基因的16个多重PCR产物进行分析需耗时70分钟,而利用LIF棒测系统则只需10分钟。
从以上的介绍可看出,毛细管电泳在基因突变检测方面具有巨大的潜力,CE检测器,毛细管分离介质等还可进一步改进以提高灵敏度和分辨率。
目前,毛细管电泳已在DNA测序,基因组绘图,基因突变分析等方面发挥了巨大的作用。
4小结
在1985年以前,研究工作者还只对大的缺失,插入及重排等突变进行分析,除非点突变影响到了限制性酶切位点,1985年以后,两种突变检测技术的问世,即DGGE和RNaseA切割,使点突变的检测成为可能。
在此基础上以及PCR方法的介入,基因突变检测技术得到了迅速发展,从而距离理想的突变扫描方法越来越接近,即:
能对大片段DNA进行扫描,100%的检出率,无假阴性或假阳性现象,不需复杂的设备,花费低,不需使用有害试剂和同位素,高效率,耗时短。
有研究工作者预言,随着DNA测序技术的不断完善和发展,在不久的将来,该技术将会取代其它方法而成为一种理想的基因突变检测技术。
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