细胞染色专题之一台盼蓝.docx
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细胞染色专题之一台盼蓝
细胞染色专题之一:
台盼蓝
台盼蓝(TrypanBlue,也称Directblue14):
一种死细胞染色用色素
化学名:
3,3'-{[3,3'-Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid),tetrasodiumsalt3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸),四钠盐分子式:
C34H24N6Na4O14S4
分子量:
960.81
CASNumber:
72-57-1
外观:
黑褐色结晶粉末
摩尔吸光度:
>69,000(在606nm附近)
染色原理:
细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说,台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性,通常认为细胞膜丧失完整性,即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试(dyeexclusion),ErythrosinB(红色)、negrosine、eosinY、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞,并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水,可以配制成10mg/ml的水溶液,水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况,用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟,在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡:
如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。
如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的,此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件:
常温保存
注意事项:
1.台盼蓝对人体有毒
2.台盼蓝染细胞时,时间不宜过长。
否则,部分活细胞也会着色,会干扰计数。
3.台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说,还比较方便,对贴壁细胞来说,较为繁琐。
因为要消化,有时,96孔板不一定能消化干净。
而且,该法是测定细胞浓度的方法,与细胞悬液的体积有关,加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。
可以说,该法相对准确,可能有一些人为因素的干扰。
细胞染色专题之二:
美蓝
美蓝
英文名:
Methyleneblue,Swissblue
中文名:
亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。
分子式:
C16H18ClN3S
分子量:
319.85g/mol
CASNumber:
61-73-4
EINECSNumber:
200-515-2
熔点:
100℃
沸点:
分解
吸收峰:
668nm和609nm。
染色原理:
美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色。
用美蓝对酵母活细胞染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
细胞染色专题之三:
吖啶橙
吖啶橙:
N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine
中文名:
3,6-双(二甲基氨基)吖啶
英文名:
AcridineOrange(AO),Euchrysine,3,6-Acridinediamine,WaxolineOrangeA,AcridineOrangeBase,SolventOrange15,RhodulineOrange,RhodulineOrangeN,AcridineOrangeNO,RhodulineOrangeNO,BasicOrange分子式:
C17H19N3
分子量:
265.35g/mol
CASnumber:
10127-02-3
外观:
橙色、红棕色粉末
染色原理:
吖啶橙(AO)与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。
AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。
一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm(激发502nm)的绿色荧光。
一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构,此结构发出最大波长为650nm(激发460nm)的红色荧光。
因此,AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或RNA。
它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。
光谱数据:
与DNA作用时和荧光素相似,激发最大波长502nm,发射最大525nm(绿光)。
于RNA作用时,激发最大波长移动到460nm(蓝光),发射最大移动到650nm(红光)。
染色程序:
1.用PBS或合适缓冲液制备10-50μMAO溶液。
a)
2.将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。
b)
3.37℃下孵育细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。
5.用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)由于AO可能具有致癌性,因此操作过程中须格外小心。
b)可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。
储存条件:
避光,冷藏保存
细胞染色专题之四:
碘化丙啶
碘化丙啶
英文名:
Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI
分子式:
C27H34I2N4
分子量:
668.39
外观:
红棕色粉末
应用:
DNA染色
染色原理:
碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物,它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。
光谱性质:
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
染色过程:
1.用PBS或适当的缓冲液制备10~50μM的PI溶液。
a)
2.将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。
b)
3.在37℃培养细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5.用535nm激发波长,615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。
a)由于PI可能具有致癌性,请小心操作。
b)也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。
保存条件:
4℃避光保存
对人体有刺激性,请注意适当防护
细胞染色专题之五:
罗丹明123
罗丹明123:
Rhodamine123
分子式:
C21H17ClN2O3
分子量:
381
外观:
橙红色、红棕色固体/粉末
溶解性:
可溶于DMSO
CASNumber:
62669-70-9
染色原理:
Rh123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针,容易被有活性的线粒体摄取,没有细胞毒性。
Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集,发出黄绿色荧光,可用于对许多种细胞进行染色,包括植物细胞和细菌。
由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性,此化合物被应用于检测细胞内的ATP。
Rh123还用于癌症研究。
光谱性质:
lex\lem(MeOH)=505nm\534nm.e(505nm,MeOH)=97,000.
染色步骤:
1.将0.4mgRh123溶解到1mlDMSO中制备成1mMRh123-DMSO溶液。
2.用载玻片准备细胞。
细胞数目应为5×10e4-5×10e5个/ml。
3.孵育该载玻片,用PBS或Hank’s液洗涤细胞。
4.用培养基稀释1mMRh123溶液以制备1-20μMRh123缓冲液。
5.将Rh123缓冲液a)加入载玻片并在37℃下孵育30分钟至1小时。
6.去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。
b)
7.用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)加入细胞前将Rh123缓冲液放在37℃下孵育。
b)洗涤细胞后为了固定,加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟,接着用PBS洗涤。
储存条件:
避光冷藏保存
细胞染色专题之六:
溴乙锭
溴乙锭:
Ethidiumbromide
化学名:
溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶
英文名:
2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide,2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridiniumbromide,3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide,3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide,Homidiumbromide,EB,EtBr
别名:
胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶
分子式:
C21H20BrN3
分子量:
394.31g/mol
CASnumber:
1239-45-8
熔点:
260-262℃(fromwiki)
性质:
从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体,熔点238~240℃;20℃时溶于20份水和750份氯仿。
染色原理:
EB不能穿过活细胞的细胞膜,然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。
EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率,所以当电泳凝胶中含有游离EB时,也可检测出少量DNA。
它是一种高灵敏的荧光试剂,也是一种重要的荧光染料,常用于检测DNA和RNA。
EB与DNA结合后抑制DNA的复制和转录。
光谱性质:
EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。
染色过程:
1.用PBS或合适的缓冲液制备10-50μMEB溶液。
a)
2.将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。
b)
3.37℃下孵育细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5.用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)由于EB可能有致癌性,操作时须十分小心。
b)可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。
储存条件:
避光,冷冻保存
细胞染色专题之七:
曙红Y
曙红:
EosinY
中文名:
水溶伊红;四溴荧光黄;朝红;四溴荧光素钠;曙红钠盐;曙红,水溶性;黄光曙红
英文名:
EosineYellowish,Bromoeosine,Tetrabromofluorescein
C.I.name:
Acidred87
分子式:
C20H6O5Br4Na2
分子量:
691.9
性质:
以AgNO3滴定Br-,I-,SCN-等时用作吸附指示剂。
CASNumber:
17372-87-1
MDLnumber:
MFCD00005040
ColourIndexNumber:
45380
光谱性质:
最大吸收524.8nm;最大激发490nm
染色原理:
EosinY为酸性染料,将胞质染成粉红色(嗜酸性),是组织和细胞化学常用染色试剂之一,常与苏木精(hematoxylin,为碱性染料,将核染成紫蓝色(嗜碱性))联合使用(HE染色法)。
在免疫组织化学实验中,常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。
存储条件:
室温避光保存
细胞染色专题之八:
苏木精
苏木精Hematoxylin
中文名:
苏木色精,苏木色素,苏木精,苏木素,洋苏木素
英文名:
He
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- 细胞 染色 专题 之一 台盼蓝