医学免疫学检验免疫荧光技术课件Word文档下载推荐.docx

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（2）免疫荧光测定技术：

抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生：

物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。

这种物质，称为荧光素。

由光激发所引起的荧光，为光致荧光；

由化学反应所引起的荧光，为化学荧光。

四、荧光素的荧光特性：

（1）停止供能，荧光现象随即终止

（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<

发射光波长（3）荧光效率：

荧光效率=发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：

荧光素的辐射能力减弱五、常见荧光素：

（1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）：

FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。

有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。

FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。

FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。

其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

（2）四乙基罗丹明（rhodamine,RB200）：

RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。

最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。

（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC）：

TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。

最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。

因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。

（4）镧系：

镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。

Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：

PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±

21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±

13nm的带通滤光片。

FL2探测器检测PE。

（6）多甲藻叶绿素蛋白（peridininchlorophyllprotein，PerCP）：

PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。

FL3探测器检测PerCP。

（7）碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：

可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。

在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。

在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。

FL2探测器检测PI。

常见荧光素的特性：

（1）FITC：

黄色结晶粉末，吸收光：

490~495nm，发射光：

520~530nm，明亮的黄绿色荧光。

（2）RB200：

橘红色粉末,吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。

（3）TRITC：

紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。

Eu、Tb（5）PE：

吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。

（6）其它：

酶作用后产生荧光物质。

酶作用后产生荧光物质：

酶底物产物激发光发射光B-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA二聚体317414酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。

例如，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。

其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。

六、合适荧光素的选择：

（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

（2）荧光效率高，标记后下降不明显。

（3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。

（4）标记后能保持生物学活性和免疫活性（5）标记方法简单、快速。

（6）安全无毒篇二：

医学免疫学CDC实验报告CDC实验一.实验原理细胞表面抗原与相应的抗体（IgG1~3或IgM）特异性结合形成的免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜穿孔。

因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反应；

不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反应。

二.实验步骤1.胸腺细胞悬液制备颈椎脱臼法处死小鼠↓暴露胸腔，分离出胸腺↓镊子夹住胸腺反复轻轻研磨↓单个细胞PBS洗２次，1000rpm，10min↓加入5%小牛血清PBS制备细胞悬液调节细胞浓度至3-4×

107/ml三.结果判断①细胞膜穿孔的细胞呈蓝色，细胞膜完整的活细胞不着色。

②细胞毒性作用的判断标准如下：

阴性反应（－）死细胞占0-10%可疑阳性反应（±

）死细胞占11-20%弱阳性反应（+）死细胞占21-50%阳性反应（++）死细胞占51-80%强阳性反应（+++）死细胞占81-100%四.结果记录1.表格记录2.照片展示五.讨论①.第①组成阳性的原因：

实验中加入抗原、抗体、补体、LC。

抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物，通过经典途径激活补体，形成攻膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成蓝色，呈阳性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体共同参与。

②.第②组成阴性的原因：

实验中加入抗体、LC。

因为无抗原和补体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复合物，不能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能被染成蓝色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有补体的参与。

③.第③组呈阴性的原因：

试验中加入LC和补体，因为无抗原抗体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体的参与。

④.第④组呈阴性的原因：

实验中只加入LC，既无抗原抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。

篇三：

免疫学诊断技术免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院陈建魁主要内容：

第一节第二节第三节第四节第五节第六节抗原抗体反应免疫学检测常用标记技术免疫细胞的检测免疫分子的检测免疫相关基因的检测免疫学检测方法的应用第一节抗原抗体反应抗原抗体反应:

抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。

应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助诊断。

1、特异性2、适合比例性3、可逆性抗原抗体反应的特异性：

一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。

抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示。

亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。

亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。

适合比例性：

抗体含量抗原含量前带等价带后带在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成最多。

如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。

出现在抗体过量时，称为前带。

在抗原过量时，称为后带。

抗体过剩抗原抗体比例合适抗原过剩网格学说（latticetheory）可逆性：

Ag+AbK（亲和常数）=AgAb抗原抗体反应的影响因素1、电解质浓度2、酸碱度（pH:

6～8）3、温度（37～42℃）抗原抗体反应类型：

根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应成分的不同，可将抗原抗体反应分为：

凝集反应沉淀反应补体参加的反应采用标记物的抗原抗体反应等颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应（agglutination）。

该类反应可检测到ug/ml水平的抗体。

1.直接凝集反应细菌或红细胞等颗粒性抗原抗体2.正向间接凝集反应载体颗粒可溶性抗原例如，用γ球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的抗人γ球蛋白的抗体（类风湿因子）。

3.反向间接凝集反应载体颗粒抗体可溶性抗原可溶性抗原（如：

血清蛋白质、细胞裂解液等）与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应（precipitation）。

液相沉淀反应絮状沉淀反应环状沉淀反应抗血清抗原+—抗原抗体+—免疫比浊法：

在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原，经一定时间后可形成免疫复合物。

用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，可根据标准曲线计算出样品中的抗原含量。

该法快速简便，可取代免疫扩散法测定Ig含量。

凝胶内沉淀反应免疫扩散技术免疫电泳技术火箭电泳单向扩散试验对流电泳双向扩散试验免疫电泳AgAbAg第二节免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术（immunolabellingtechnique）是指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。

此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。

广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。

根据标记物与检测方法不同，标记技术可分为:

免疫荧光技术放射免疫测定免疫酶标技术发光免疫分析免疫金标记技术主要的免疫标记物类别荧光素标记物FITC、藻红蛋白（PE）用途免疫组化免疫分析测定放射性核素酶3H、51Cr、32P、125I、131I免疫分析测定免疫组化免疫分析测定HRP、AP化学发光物Luminol金属颗粒胶体金免疫分析测定免疫组化免疫分析测定用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。

（一）免疫荧光显微技术1直接荧光法：

将荧光素直接标记抗体，作标本染色。

优点:

简便易行。

缺点:

每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。

2间接荧光法：

首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。

敏感性高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检查。

缺点：

非特异性荧光容易增多。

3补体结合免疫荧光法行示踪。

在抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；

再用荧光素标记的抗补体抗体进直接法间接法补体法双标记法

（二）流式细胞术（flowcytometry，FCM）免疫荧光技术应用于流式细胞仪,可对细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测,并可将不同类型的细胞分选收集。

FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，是生命科学研究领域广泛应用的一项新技术。

（三）荧光免疫测定（fluoroimmunoassay，FIA）1.荧光偏振免疫测定：

（fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在恢复至基态后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样品中待测物质的浓度。

主要用于小分子物质（特别是药物浓度）的测定。

2.时间分辨荧光免疫测定（time-resolvedfluoro-immunoassay，TR-FIA）镧系稀土元素具有较长的荧光寿命，用其标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可以消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是特异荧光，此法灵敏度高、特异性好。

3.酶联荧光免疫测定（enzymelinkedfluoro-immunoassay，ELFIA）应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光仪进行定量测定。

放射免疫测定法（radioimmunoassay,RIA）是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术。

将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml水平。

常用的放射性核素有125I和131I。

常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE等。

三、免疫酶标技术以酶标记抗体（或抗原）用于免疫学检测，通过酶催化底物显色，对细胞或组织标本中的抗原-抗体复合物进行定位、定性分析；

亦可根据酶催化底物显色的深浅程度，定量测定体液中抗原或抗体的含量。

（一）酶免疫组织化学技术（enzymeimmunohistochemistry,EIH）通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。

酶免组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。

辣根过氧化物酶的底物二氨基联苯胺（DAB）的分解产物适于电镜观察。

常用的方法：

亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin–biotin-peroxidasecomplex，ABC），过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP）和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（APAAP）。

（二）酶免疫测定（enzymeimmunoassay，EIA）1.非均相酶免疫测定（heterogeneousenzymeimmunoassay）根据是否使用固相支持物作为吸附抗体（或抗原）的载体，可分为固相EIA和液相EIA两类方法。

其检测的敏感度达ng~pg/ml水平。

常用的固相EIA法是酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA），此法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体。

（1）双抗体夹心法：

用于检查特异抗原。

首先将已知抗体包被在酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。

一般而言，包被抗体和酶标记抗体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的2种抗体。

（2）间接法：

用于检查特异抗体。

用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。

免疫印迹法（Immunoblotting）：

它将凝胶电泳与固相免疫结合，是把电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。

此法能分离不同分子大小的蛋白质并确定其分子量，常用于检测病毒的抗体或抗原。

免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）是将免疫反应的特异性与聚合酶链反应（PCR）的敏感性相结合的免疫学检测技术。