新支流法规程标准Word文件下载.docx

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含量应≥108.0EID

。

1.2.1.6安全性用2~7日龄SPF雏鸡20只,分为两组,第1组10只,每只滴鼻接种5倍稀释的含毒胚液0.05ml;

第2组10只,不接种作为对照。

两组在同条件下分别饲养管理,观察10日,应无不正常反应。

如有非特异性死亡,免疫组和对照组均应不超过1只。

1.2.1.7免疫原性对30日龄SPF雏鸡滴鼻免疫,最小免疫剂量应

≤5000EID

1.2.1.8特异性将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释（约含

/0.1ml）,与等量抗新城疫病毒特异性血清混合,置室温中和1小时后,105.0EID

尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个,每胚0.2ml;

同时设病毒对照10个,尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液,每胚0.1ml,观察120小时。

在24~120小时内中和组鸡胚应不引起特异性死亡且至少存活8个,鸡胚液作红细胞凝集试验,应为阴性;

对照组鸡胚应至少死亡7个,且鸡胚液作红细胞凝集试验应为阳性。

1.2.1.9纯净按现行《中国兽药典》进行检验,应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.1.10基础种子代数E4-1~E4-10代。

1.2.1.11毒种保存在-70℃以下保存,有效期为72个月。

1.2.2鸡新城疫病毒北京株（CVCCAV1611株）应符合下列标准

1.2.2.1对鸡最小致死量用2~8月龄SPF鸡4只,各肌肉注射10-7或10-8稀释度的病毒液1ml,14日内应全部死于新城疫。

1.2.2.2对鸡胚半数致死量将毒种作10倍系列稀释,取10-6、10-7、10-83个稀释度,各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个,每胚0.1ml,记录接种后24~72小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚,计算ELD

每0.1ml病毒含量应

≥107.0ELD

1.2.2.3纯净性按现行《中国兽药典》进行检验,应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.2.4毒种保存在-70℃以下保存,有效期为72个月。

1.2.3传染性支气管炎病毒M41株应符合下列标准

1.2.3.1对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释,尿囊腔内接

种10日龄SPF鸡胚10个,每胚0.1ml,鸡胚应于接种后24~144小时内全部或

部分死亡。

存活的鸡胚应表现胎儿失水、卷缩、发育小等特异性病痕,其尿囊液

对1%鸡红细胞凝集试验应为阴性。

1.2.3.2病毒含量每0.1ml病毒含量应不低于106.0EID

1.2.3.3对雏鸡的毒力用1~7日龄SPF鸡10只,每只以10倍稀释的毒

种滴鼻1~2滴（0.025~0.050ml）,观察10日,至少应有8只出现鸡传染性支

气管炎的典型症状。

/0.1ml）,

1.2.3.4特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍（含104.0EID

与等量鸡抗传染性支气管炎特异性血清混合,置室温中和1小时后,尿囊腔内接

种10日龄SPF鸡胚10个,每胚0.2ml;

同时设病毒对照10个,尿囊腔内接种

100倍稀释的毒液,每胚0.1ml,观察至144小时。

在24~144小时内中和组鸡

胚应无特异性死亡及鸡胚病变,对照组鸡胚死亡和出现特异性病变的胎儿总数应

至少8个。

1.2.3.5免疫原性将毒种接种10日龄SPF鸡胚繁殖,取病毒含量≥

106.0EID

/0.1ml的鸡胚液,灭活后按1:

3（水相:

油相）的比例制成灭活疫苗。

用14~50

42日龄SPF鸡25只,20只各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120株）

1羽份（0.05ml）,另5只不接种作为对照。

接种后21~28日,分别采血,分离

血清,再颈部皮下或肌肉接种灭活疫苗0.3ml/只,第二次接种后21~28日,再

分别采血,分离血清,将两次血清分别作HI抗体效价测定。

免疫组二免血清HI

抗体效价的几何平均值（GMT）应较首免血清高4倍以上,对照组血清HI抗体效

价的几何平均值应不高于1:

8（微量法）。

1.2.3.6纯净按现行《中国兽药典》进行检验,应无细菌、霉菌、支原

体及外源病毒污染。

1.2.3.7基础种子代数E1~E6代。

1.2.3.8毒种保存在-70℃以下保存,有效期为72个月。

1.2.4禽流感病毒YBF003株应符合下列标准

1.2.4.1对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10000倍稀释（约含

103.0EID

/0.1ml）,尿囊腔内接种10~11日龄SPF鸡胚10个,每胚0.1ml,置36~50

37℃继续孵育,在接种后60~120小时内,应至少有8个鸡胚死亡。

胎儿应表现

全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。

1.2.4.2对雏鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释,经翅静脉接种28~56日龄SPF鸡10只,每只0.2ml,接种后14日内,应不出现死亡或明显异常反应;

接种后3~5日,采集每只鸡的泄殖腔拭子,经处理后,分别经尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚5个,每胚0.2ml,孵育观察5日,无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价,每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的红细胞凝集价不低于1:

16（微量法）,即可判为病毒分离阳性;

对病毒分离阴性的样品,应盲传一次后再进行判定。

应至少9只鸡病毒分离阳性。

1.2.4.3病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释,取10-6、10-7、10-83个稀释度,各尿囊腔内接种10~11日龄SPF鸡胚5个,每胚0.1ml,置36~37℃继续孵育,每日照胚2次,24小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在24~120小时内死亡的鸡胚随时取出,收获鸡胚液,同一稀释度的胚液等量混合,按稀释度分别测定红细胞凝集价,至120小时,取出所有活胚,逐个收取鸡胚液,

分别测定红细胞凝集价,凝集价不低于1:

16（微量法）者判为感染,计算EID

每0.1ml病毒含量应≥107.0EID

1.2.4.4红细胞凝集价（HA）毒种对鸡红细胞凝集价（HA）应不低于1:

256（微量法）。

1.2.4.5毒种特异性

1.2.4.5.1血凝抑制试验毒种与抗H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应,与SPF鸡血清、禽流感（H5、H7亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清均应为阴性反应。

1.2.4.5.2鸡胚中和试验将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释,与等量抗H9亚型禽流感病毒特异性血清混合,室温中和1小时后,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个,每胚0.2ml;

在24~120小时内中和组鸡胚应无特异性死亡,且应至少有9个健活,鸡胚液作红细胞凝集试验,应为阴性反应;

对照组鸡胚应至少有8个死亡,且鸡胚液作红细胞凝集试验均应为阳性反应。

1.2.4.6免疫原性取红细胞凝集价不低于1:

256（微量法）的鸡胚液,灭活后按1:

油相）的比例制成灭活疫苗,颈部皮下接种21~28日龄SPF鸡10只,每只0.2ml,另取10只不接种作为对照。

21日后采血,分离血清,测定HI抗体效价,同时翅静脉注射10倍稀释的YBF003株病毒液,每只0.2ml,

于攻毒后3~5日采集泄殖腔拭子,经处理后,尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚5个,每胚0.2ml,孵育观察5日,无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价,每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:

16（微量法）,即可判为病毒分离阳性。

免疫组血清HI抗体效价的几何平均值应不低于1:

180（微量法）,且病毒分离至少9只为阴性;

对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:

4（微量法）,且病毒分离至少9只为阳性。

1.2.4.7纯净按现行《中国兽药典》进行检验,应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.4.8基础种子代数E5~E15代。

1.2.4.9毒种的保存在-70℃以下保存,有效期为60个月。

1.2.5表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌（S-VP2蛋白）应符合下列标准

1.2.5.1形态和生化特性培养物涂片为革兰氏阴性短杆菌,可成短链状,在不良的培养条件下可呈现长丝状。

埃希氏大肠杆菌分解葡萄糖,产生的二氧化碳和氢气大约相等;

在蛋白胨肉汤中产生吲哚;

在0.5%葡萄糖肉汤中,于37℃培养4日后,培养基的pH值低于4.5,甲基红试验呈阳性反应;

Voges-Proskauer二氏反应（V.P.反应）阴性;

枸橼酸盐试验阴性。

1.2.5.2培养特性LB固体培养平板上的形状为圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落。

在加有卡那霉素的培养基中能生长。

1.2.5.3鉴别检验

（1）PCR检测（检测VP2是否表达）在LB固体培养平板上挑取单菌落,加100μl灭菌双蒸水,沸水浴5分钟后,用自备PCR引物扩增VP2基因全片段或部分片段。

使用以下引物进行单菌落DNA扩增能得到约1400bp的扩增片段。

引物15′-CCGAATTCATGACAAACCTGCAAGATC-3′

引物25′-GGAAGCTTTCCTTATGGCCCGGATTATG-3′

使用以下引物扩增能得到222bp的DNA片段。

引物15′-ACAGATTGTTCCGTTCATACG-3

引物25′-TCGAACTTGTAGTTCCCATTG-3’

（2）琼脂扩散试验（AGP,检测表达的VP2蛋白是否有活性）将LB固体培养

平板上的工程菌单菌落接种于LB液体培养基中,培养至OD

值在0.6~1.0之间

600

时加入0.2mol/Lα乳糖,至终浓度为0.02mol/L,持续培养5~8小时,收集菌体,超声破碎,8000rpm离心去沉淀,上清液与抗鸡传染性法氏囊病毒特异性血清进行AGP试验,应出现特异的沉淀线。

1.2.5.4免疫原性将AGP效价不低于1∶16的表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的基因工程菌液灭菌后按1∶3（水相∶油相）的比例制成灭活疫苗。

取21~28日龄SPF鸡20只,其中10只各接种疫苗0.2ml,另10只不接种作为对照,同条件下隔离饲养。

接种后21~28日,所有免疫鸡和对照鸡经点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液,0.1ml/只（实含毒量≥100个BID）。

攻毒后,每日观察鸡只的临床表现,记录发病和死亡鸡数,至72~96小时,扑杀存活鸡,逐只剖解,观察法氏囊等病变。

免疫鸡应至少8只正常,不出现法氏囊病病变;

对照鸡应至少8只发病,出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。

1.2.5.5菌种传代取标准保藏菌种管,进行管外表面消毒后打开,加入LB培养液少许,用接种棒在加有卡那霉素的LB培养平板上划线。

倒置后37℃培养24小时,挑取单菌落,转接于加有卡那霉素的LB培养液中,37℃振荡培养16~18小时。

然后用接种棒在加有卡那霉素的平板或斜面上划线,37℃培养20小时。

封口后,2~8℃保存（10日）。

再从平板上挑取单菌落,按上述方法继续传代。

1.2.5.6纯粹用适宜培养基检查,应纯粹。

1.2.5.7菌种代次基础种子代数1~20代,一级种子继代应不超过4代。

1.2.5.8保存培养物冻干保存,-20℃下有效期为24个月。

1.2.6强毒标准鸡传染性法氏囊病毒BC6-85株（CVCCAV7株）应符合下列标准。

1.2.6.1对鸡的感染量将种毒作10倍系列稀释,取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度,分别点眼接种28~42日龄SPF鸡,0.1ml/只。

攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况,记录发病和死亡鸡数,剖检观察死亡鸡法氏囊等病变,至96小时扑杀存活鸡,逐只剖解,观察法氏囊等病变,以法氏囊肿大、萎缩、发炎、有分泌物等任一项临床表现,判为感染。

最小感染量（BID）应≥10-4.0/0.1ml。

1.2.6.2特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至105.0ELD

∕0.1ml,与等量

抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合,置室温中和1小时,以绒毛尿囊膜途径接

种10~12日龄SPF鸡胚10个,每胚接种0.2ml;

同时设病毒对照10个,每胚

∕0.1ml）,同条件观察168小时。

在24~168小接种病毒液0.1ml（含105.0ELD

时内中和组鸡胚应全部健活,对照组鸡胚至少死亡9个,鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验（HA）应均为阴性。

1.2.6.3纯净检验按现行《中国兽药典》进行检验,应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.6.4保存在-20℃以下保存,有效期为24个月。

在-70℃以下保存,有效期为60个月。

2疫苗制造及半成品检验

2.1生产用毒种制备

2.1.1鸡新城疫病毒LaSota株生产用毒种制备

2.1.1.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

选接种后72~120小时死亡且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水）,装于灭菌容器内。

将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:

512（微量法）的鸡胚液混合,定量分装于无菌安瓿中,冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

2.1.1.2毒种鉴定按1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.1.8和1.2.1.9项进行,应符合规定。

2.1.1.3毒种保存在-15℃以下,应不超过6个月。

2.1.1.4毒种继代应不超过3代。

2.1.2鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备

2.1.2.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2~10-3）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

选接种后30~48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液（尿囊液及羊水）,装于无菌容器内。

将检验无菌、

/0.1ml、对1%鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合,定量分病毒含量≥106.0EID

装于无菌安瓿中,冷冻保存。

2.1.2.2毒种鉴定按本试行规程1.2.

3.1、1.2.3.2、1.2.3.4、1.2.3.6项进行,应符合规定。

2.1.2.3毒种保存在-15℃以下保存,应不超过6个月。

2.1.2.4毒种继代应不超过3代。

2.1.3禽流感病毒YBF003株毒种制备

2.1.

3.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或10-4）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

256（微量法）的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存,注明收获日期、毒种代次等。

3.2毒种鉴定按1.2.

4.1、1.2.4.3、1.2.4.4、1.2.4.5、1.2.4.7项进行,应符合规定。

3.3毒种保存在-15℃以下,应不超过6个月。

3.4毒种继代应不超过3代。

2.1.4表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生产用菌种制备

2.1.4.1一级种子繁殖和鉴定将各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中,35~36℃培养24小时,然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养,选取符合1.2.5.2项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中,接种于LB琼脂斜面若干支、置35~36℃培养20~24小时,作为一级种子。

在2~8℃保存,不超过14日;

在培养基上传代,应不超过4代。

2.1.4.2二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中,35~36℃培养20~24小时。

置2~8℃保存,应不超过3日。

2.2制苗材料选择鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒液的制备,选择发育良好的10~11日龄易感鸡胚作为制苗材料。

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌的培养基为改良LB培养基,见附注。

2.3制苗用病毒液的制备

2.3.1鸡新城疫病毒液的制备

2.3.1.1接种取生产用毒种,用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,按《全自动接种机使用说明》要求,接种10~11日龄易感鸡胚,每胚0.1ml,接种后密封针孔,置36~37℃继续孵育,不必翻胚。

2.3.1.2孵育与观察鸡胚接种后,每日照胚1次,将60小时前死亡的鸡胚弃去。

此后,每4~6小时照胚1次,死亡的胚随时取出,至96小时,无论死亡与否,全部取出,气室向上,置于2~8℃冷却12~24小时。

2.3.1.3收获将冷却的鸡胚取出,按《全自动收获机使用说明》要求,收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内,抽

样测定红细胞凝集价。

凝集价低于1:

256（微量法）者应弃去。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植）,应无菌生长。

收获的胚液灭活前在2~8℃保存,应不超过5日。

2.3.1.4浓缩将收获的胚液在2~8℃条件下,用超滤浓缩机浓缩,至少浓缩4倍,抽样测定红细胞凝集价,凝集价不低于1:

2048（微量法）时停止浓缩,按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植）,应无菌生长,并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

2.3.1.5灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内,计量加入10%甲醛溶液,开启搅拌机搅拌,使其充分混合,甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中,以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时,开启搅拌机连续搅拌）后取出,放2~8℃保存,应不超过1个月。

2.3.2鸡传染性支气管炎病毒液的制备

2.3.2.1接种取生产用毒种,用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2或

10-3）,按《全自动接种机使用说明》要求,接种10~11日龄易感鸡胚,每胚0.1ml,接种后密封针孔,置36~37℃继续孵育,不必翻胚。

2.3.2.2孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次,弃去死胚。

此后每4小时照胚1次,死亡的鸡胚随时取出,直至48小时,无论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2~8℃中冷却12~24小时。

2.3.2.3收获将冷却的鸡胚取出,按《全自动收获机使用说明》要求,收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内,抽样检测病毒含量,应≥106.0EID

/0.1ml。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检

验（可不移植）,应无菌生长。

2.3.2.4浓缩将收获的胚液在2~8℃条件下,用超滤浓缩机浓缩,至少浓缩4倍,同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植）,应无菌生长,并留样备测毒价。

2.3.2.5灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内,计量加入10%甲醛溶液,开启搅拌机搅拌,使其充分混合,甲醛的最终浓度为0.1%。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时,开启搅拌机连续搅拌）后取出,放2~8℃保存,应不超过1个月。

2.3.3H9亚型禽流感病毒液的制备

2.3.3.1接种取生产用毒种,用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或

10-4）,按《全自动接种机使用说明》要求,接种10~11日龄易感鸡胚,每胚0.1ml,接种后密封针孔,置36~37℃继续孵育,不必翻胚。

2.3.3.2孵育和观察鸡胚接种后,每日照胚1次,将48小时前死亡的鸡胚弃去。

此后,每4~6小时照胚1次,死亡鸡胚随时取出,直至96小时,无论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2~8℃冷却12~24小时。

2.3.3.3收获将冷却的鸡胚取出,按《全自动收获机使用说明》要求,收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内,抽样测定红细胞凝集价。

同时按《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植）,应无细菌生长。

2.3.3.4浓缩将收获的鸡胚病毒液在2~8℃条件下,用超滤浓缩机浓缩,至少浓缩4倍,抽样