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1.1907:
罗斯•哈里森(RossHarrison)报道离体神经纤维生长,首次成功克服基本的培养问题并创造了一种可效仿的细胞培养技术:
将蛙胚神经管的组织移植到无菌盖玻片上的一滴新鲜蛙淋巴液中,淋巴液凝块后,将盖玻片反转过来放置在凹玻片的凹窝上方进行悬滴培养,离体观察细胞。
解决了细胞培养中的培养基、培养器皿、观察和细胞污染(这一点他没有碰到)等基本问题。
由于培养时间相对较短,他没有碰到补给培养基和继代接种的问题。
2.1910-1923,Carrel开展体外器官培养,并开始用新鲜血浆培养同种动物组织,改进培养基和培养方法,尤其是培养器皿,1923年出现第一个实用的细胞培养瓶d-flask,容易添加培养基,可以持续培养数周再传代接种。
20年代中期,卡莱尔实验室所开发和改进的开拓性的组织培养技术成为全球各地大多数细胞培养实验室广为使用的方法。
此后25年培养技术几乎没有变化,直至1950年代人们开发出定量测量技术、合成培养基并使用胰岛素解离组织并对产生的细胞系进行传代培养,使培养技术获得了飞速的发展。
3.1950s-从转瓶到生物反应器:
新细胞培养应用要求生产的细胞数量大于以往任何时候。
为了满足这些需求人们开发了新的悬浮培养方法。
如今,搅拌罐式生物反应器中生长的细胞产生了年产值数百亿美元的药物。
为了满足如今对细胞类药物的需求,生物技术和制药公司往往使用容积为1升至高达20000升的大规模搅拌式生物反应器。
三.细胞培养技术
细胞培养技术也叫细胞克隆技术,在生物技术领域是一个必不可少的过程,细胞培养,既包括微生物细胞的培养,也包括植物或动物细胞培养。
利用细胞培养技术,由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞,得到大量的细胞或其代谢产物,是生物技术中最核心、最基础的技术。
在此主要介绍动物细胞的培养。
1.细胞培养的优点:
细胞培养主要具有两个方面的优点,其一是人工培养条件易于改变并能严格控制,便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响;
其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代,因此可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。
2.细胞培养的缺陷:
细胞培养技术也存在着一定局限性,主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系,失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用,特定分化基因的表达减弱或停止,而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持,遂使体内外细胞出现了差异,这是应用细胞培养技术应该注意的问题。
3.细胞培养的应用
(1).科学研究:
药物研究开发与基础研究
1)药物开发研究①新药筛选:
如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。
②疫苗研究与开发:
如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
③基因工程药物研究与开发:
如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等。
④细胞工程药物研究与开发:
生物活性多肽研究与开发,人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
⑤单克隆抗体制备:
包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。
2)基础研究对于药物作用机制、基因功能、疾病发生机制等基础
(2)药物生产:
①疫苗生产如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
②基因工程药物生产:
如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等③诊断用和药用单克隆抗体生产④细胞工程药物生产:
生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等
4.细胞类型
体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中,根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性,可分为贴附型和悬浮型两大类。
1)贴附型:
大多数培养细胞均为贴附型,它们必须贴附在支持物表面生长,这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态,但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征,多呈上皮样或成纤维细胞样。
A.成纤维细胞:
由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵园形核,胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起,除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
B.内皮型细胞:
此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征,细胞中央有园形8核,细胞紧密相连单层膜样生长。
起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时,皆呈上皮型形态生长
C.游走型细胞:
在支持物上散在生长,一般不连成片。
细胞质经常伸出伪足或突起,呈活跃的游走或变形运动,速度快且不规则。
此型细胞不很稳定,有时亦难和其它型细胞区别。
在一定的条件下,由于细胞密度增大联成片后,可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。
常见于羊水细胞培养的早期。
正常贴附型细胞具有接触抑制的特性,细胞相互接触后可抑制细胞的运动,因此细胞不会相互重叠于其上面生长。
细胞生长、汇合成片后,虽发生接触抑制,但只要营养充分,仍可增殖分裂,但当细胞数量达到一定密度后,由于营养的枯竭和代谢物的影响,细胞分裂停止,称为密度抑制。
肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失,因此细胞可向三维空间发展,导致细胞堆积,并可生长至较高的终末细胞密度。
2)悬浮型细胞
少数细胞在培养时不贴附于支持物上,而以悬浮状态生长,包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞,尤其是血液白细胞,以及一些肿瘤细胞。
细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团,胞体为圆形。
其优点是在培养液中生长,生存空间大,允许长时间生长,便于大量繁殖。
在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的,结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁。
在细胞机能状态不良时,细胞轮廓会增强,反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等,表明细胞代谢不良。
三.细胞培养条件
细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基,即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质,就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境,使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。
它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
细胞培养基组成成分主要有:
水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。
随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展,作为细胞培养领域中最基本的原料-细胞培养基的用量也迅速增加,被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域。
细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。
但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。
1.培养用水体外培养的细胞对水质特别敏感,对水的纯度要求较高。
培养用水中如果含有一些杂质,即使含量极微,有时也会影响细胞的存活和生长,甚至导致细胞死亡。
用金属蒸馏器制备的蒸馏水,可能会含有某些金属离子,一般不作为培养用水。
配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。
最好用龙头瓶贮存,存放时间一般不应超过2周。
2.营养物质
能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。
就成分而言,包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。
来自于动物体液和分离组织提取的天然培养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等,但制作过程复杂,批间差异大,已逐渐被合成培养基取代。
1)维持细胞生长的营养条件:
A.氨基酸是细胞合成蛋白质的原料,体外培养的培养基内都含有12种必需氨基酸和在细胞代谢过程中有重要作用的谷氨酰胺,其中的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源。
B.糖是细胞生长能所需能源的来源,也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。
C.维生素作为代谢过程中的辅酶、辅基,必不可少。
D.无机离子与微量元素,细胞生长必须成分。
2)促生长因子:
各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态(分化或未分化)具有十分重要的作用。
3)细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。
4)气体也是细胞生存的必需条件,所需气体丰要是氧和二氧化碳。
氧参与代谢,产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。
二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞所需成分,它主要与维持培养基的pH有直接关系。
在体外培养时,一般置细胞于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中培养。
5)抗生素:
加一定量青霉素和链霉素防止污染
3.血清
细胞培养的发展,培养基的质量是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用,是医药生物技术产品中重要的原材料之一。
血清指血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。
血清中含有多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)、多种金属离子、激素、促贴附物质(纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等)、各种生长因子、转移蛋白和不明成分等,其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。
几乎是通用的生长添加物,适用于不同种类的细胞培养,无需针对不同细胞系优化培养基,保证细胞生长。
血清对细胞培养的作用:
有利方面:
促进细胞生长;
促粘附;
常用浓度:
5-10%
不利影响:
存在细胞生长抑制因子或毒性因子;
易受污染,影响因素过多;
价格昂贵,使用不便;
伦理学因素;
细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清最常用。
选择用牛血清培养细胞的原因:
来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。
牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
分为胎牛血清和新生小牛血清。
胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵。
新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。
如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种。
虽然血清含有促进细胞生长的成分,但其质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞生长,某些批次可能还有含有内毒素、血色素、补体、抗体等毒性或抑制细胞生长的有害成分,影响细胞生长甚至导致细胞死亡。
低质量的血清常被病毒、真菌和支原体等微生物感染。
此外,血清来源不稳定,可能受来源地区环境及牛群疾病影响发生供应紧张,造成价格上的波动。
血清使用上也不方便,保存和处理均较麻烦。
为保证实验结果的准确性、可重复性和稳定性,减少细胞污染,简化提纯和鉴定程序,采用无血清培养是细胞培养的趋势。
所谓的无血清培养基是不含动物血清或其他生物提取液,但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。
无血清培养有两个方向:
一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分;
二是培养基中不含有不明确的添加组分。
当前应用较多的无血清培养基主要有4种:
1.以各类可代替血清功能的生物材料配制的培养基:
如添加牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质,以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。
其中蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确,并含有大量的动物来源蛋白。
2.无动物来源培养基:
基于生产重组药物安全的考虑,添加非动物来源的蛋白或水解物,保障细胞生长及增殖的需要。
3.无动物蛋白培养基:
完全不用动物来源的蛋白,有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。
组分相对稳定,但必须添加类固醇激素和脂类前体,只能适应某些特异细胞株。
4.化学组分限定培养基:
是目前最安全理想的培养基,性质确定、配制方便,可保证培养基批次间的一致性,其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组分。
无血清培养基可满足细胞生长需要,避免了血清的许多不利因素。
优点在于:
1)组分稳定可大量配制,蛋白含量低,不含有丝分裂原抑制剂可促进细胞增殖,简化各种提纯和鉴定细胞产物的程序。
2)在无血清培养条件下,细胞的生长速率和细胞密度及蛋白的表达水平都不亚于血清培养,甚至在某些方面超过血清培养。
含血清的合成培养基中,往往不能较长时间地维持细胞高密度培养,衰退细胞蛋白酶释放可降解蛋白类目的产物,对蛋白类生物制品的生产极为不利。
3)无血清培养基粘度小,对于搅拌等机械因素耐受力更强;
因此在控制细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的调节机制的研究中和细胞工程等现代生物技术中,对一致性和确定的条件要求,来自产物纯化的生物技术上的压力,世界范围的血清供应的逐渐紧张的情况,以及严格的质量控制要求,使得无血清培养已成为未来细胞培养的趋势。
无血清培养基目前价格偏高,通用性不高,不同类型的细胞株或细胞系可能需要不同的添加成分。
细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
而且在去除血清的同时,也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用,因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。
其他试剂
细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
1)平衡盐溶液简称盐溶液,主要包含无机盐、葡萄糖等组分,兼具缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应等特点。
用于组织块的漂洗、细胞的漂洗以及试剂配制等,其主要作用是维持细胞内外渗透压的平衡、保持pH值稳定并能够为细胞的生长提供简单的营养和必需的无机离子。
2)进行原代培养时常常需要将组织块消化解离成细胞悬液,继代培养过程中也需要将贴壁细胞从培养容器壁上用消化液消化下来。
目前细胞培养过程中所用的消化液主要有胰酶、EDTA溶液以及胶原酶等。
(i)胰酶是细胞培养过程中使用最多的消化液,通过水解细胞间的蛋白质使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样,并且与胰酶浓度、温度和作用时间有关,在pH8.0、37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。
因此,在使用胰酶消化细胞时,应控制好浓度、温度和作用时间,以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清可降低胰酶的活性,配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液,而相应的,在终止消化时,可用含有血清的培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
(ii)EDTA是另一种比较常用的细胞消化液,通过破坏细胞间的连接,达到分散细胞的目的。
对于某些贴壁特别牢固的细胞,还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。
(iii)胶原酶在上皮类细胞培养过程中经常用到,作用对象是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。
胶原酶活性不受Ca2+、Mg2+以及血清的影响,配制时可用PBS。
3)培养体系的酸碱度(pH值)对于细胞的正常生长至关重要,一般需维持在pH7.2-7.4之间,最低不能低于6.8,因此,细胞培养基中需要添加pH调整液以维持pH的稳定,目前常用的两种pH调整液有HEPES溶液和NaHCO3溶液。
四.培养技术
细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
1.细胞培养设备
1)培养器皿
体外培养细胞是一个多步骤,并要求无菌操作的过程,这决定了在细胞培养阶段所使用的耗材需要具有更高的品质要求。
小规模细胞培养往往选择细胞培养瓶、皿或者细胞培养板作为细胞培养容器。
但不同的实验需求和细胞,选择的细胞培养容器也有差异。
比较而言,细胞培养瓶成本较高,操作较为费事,但细胞培养瓶具有不易污染的特点,因此常用于长时间连续传代、扩增细胞或贵重细胞的培养;
相对的,细胞培养皿成本较低,操作较为方便,但缺点在于大量或长时间培养时容易出现污染,因此,细胞培养皿常被用来短时间培养实验所需的细胞;
细胞培养板规格多样,从较小体积的96孔板到4孔板,在一块板上可以同时实现多种细胞培养或者对同一种细胞给以不同的处理,均一性好,孔与孔之间可比性高,因此,在做克隆挑选或者高通量筛选时能够发挥最大的优势。
此外,在选择合适的细胞培养器皿时,表面处理工艺也是必须考虑的一个重要因素。
贴壁细胞培养往往要求培养器具表面具有更强的细胞结合能力,而对于强调悬浮培养的细胞,超低细胞结合表面是更为理想的选择。
2)无菌操作环境的维护
体外培养细胞时,需要细胞培养箱、超净工作台或者生物安全柜、离心机等仪器设备提供合适的培养、操作洁净环境。
A.污染
无菌操作是细胞培养过程中最基本、但也是最重要的要求之一。
任一步骤、任一培养相关的试剂、耗材、甚至仪器受到污染,对整个培养工作都可能造成严重影响。
绝大多数受污染的细胞,都需抛弃,并需对培养环境进行彻底的消毒。
依照成分,细胞培养中出现的污染可分为化学污染和生物污染,其中化学污染主要出现在细胞培养基以及其他各种细胞培养用试剂中。
细菌内毒素是革兰氏阴性细菌死亡后解体释放出的疏水性细胞壁组成物质,在化学污染中较常见,对细胞生长和实验结果产生影响。
细菌内毒素是临床上最主要的热原,通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更需避免细菌内毒素的污染。
在科研中更容易遇到生物污染,包括细菌、霉菌和酵母污染和病毒、支原体污染以及细胞间的交叉污染等。
对于较易发现的生物污染,往往可以通过及时采取措施(如抗生素)而减少其影响范围,但对于诸如支原体等很难及时发现的污染,损失极大。
B.超净工作台和无菌操作
超净工作台是国内多数细胞培养实验室配置的洁净设备,通过双层过滤装置实现对空气的过滤除菌,并将此洁净空气以一定的速率匀速通过操作区,从而形成无菌无尘的高度洁净操作环境。
良好的超净工作台是保证细胞培养过程中无污染的关键设备,特别在环境较差或者不具备无菌操作间的细胞实验室,尤为重要。
超净工作台只能对操作区间的物品进行保护,在培养对操作者以及环境具有潜在威胁的细胞时,需要保护操作者及外部环境,则需要配置生物安全柜。
对于常用的超净工作台,主要是通过紫外灯进行表面灭菌,效率有限,因此,在操作时
尽量减少容器在中敞口的时间,使用一次性血清移液管转移液体(细胞培养过程中,往往需要进行较大体积的液体操作,移液管是细胞培养室的必备用品之一。
最早的移液管为玻璃制品,可以高温高压灭菌并反复使用,但是由于玻璃制品的易碎性以及反复灭菌潜在的风险,尽量使用一次性移液管),减少物品反复进出安全柜的次数。
细胞培养过程中,除培养箱、超净工作台等较专用仪器外,还需要用到离心机、水浴锅、冰箱,显微镜等其他常规实验室设备,同样要注意避免在使用这些仪器时带入污染。
环境及腔体灭菌方法:
高温>
甲醛、双氧水、酒精>
紫外线
C.细胞培养箱
细胞培养箱作为细胞体外生长的场所,为其提供一个无菌干净的环境,同时在温度、湿度及CO2浓度上进行严格控制,创造了细胞与微生物正常生命活动的环境条件,使之在脱离复杂机体内环境的直接影响,在体外生长繁殖。
依其加热形式划分,主要有水套式和气套直热式两大类型。
细胞培养箱之所以称为CO2培养箱,最关键的一个原因是其能够控制腔体内的CO2浓度。
体外培养细胞,需要维持细胞培养基一定的pH值,对绝大多数细胞而言,pH7.2~7.4是相对理想的酸碱度环境。
细胞生长过程中,由于代谢产物CO2释放量的增多,细胞培养基会逐渐变酸,因此,细胞培养基中往往需要添加NaHCO3缓冲液以调节体系的pH值。
培养箱中CO2浓度应与细胞培养基中NaHCO3浓度保持一定的平衡。
温度是影响细胞生长的重要参数之一。
绝大多数细胞在37℃环境下能够良好生长,细胞培养箱温度的变化往往对细胞的正常生长造成较大影响。
此外,细胞培养基成分多样,各成分浓度与维持细胞内外渗透压的平衡关系密切。
由于水分蒸发,培养基各组分浓度随之升高,容易引起细胞内外渗透压的不平衡而导致细胞皱缩破裂,因此,控制细胞培养箱腔体的湿度水平显得尤为重要。
培养细胞的生长周期
体内细胞生长在动态平衡环境中,而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器,生存空间和营养是有限的。
当细胞增殖达到一定密度后,则需要分离出一部分细胞和更新营养液,否则将影响细胞的继续生存,这一过程叫传代(Passage或Subculture)。
每次传代以后,细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。
另外,很多细胞在体外的生存也不是无限的,存在着一个发展过程。
所有这一切,使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点(生存空间和营养有限;
有限的生存周期)。
培养细胞的生命期指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
一般的细胞生命归宿从最初的第一代培养进入传代期,最终衰退,所以其生长周期可分为原代培养期、传代期和衰退期。
1)原代培养:
也叫初代培养(Primaryculture),即从体内取出细胞或组织,中途不分割培养物的第一次培养过程。
也有把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
较为严格地说是指成功传代之前的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留二倍体数。
由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物活性很好的实验对象。
自供体取得组织,分离得到所需细胞后接种于培养瓶,进行原代培养。
通常步骤是:
将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶),置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。
培养材料可以为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液和组织块,对于细胞悬液可以通过低速离心去除杂质,对于组织块分离
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