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western转膜条件

western转膜条件

蛋白来源：

RAW264.7总蛋白

蛋白名称（可）：

一些转录因子

蛋白分子量：

40~70KD

WB用膜类型、孔径：

0.45NC

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流400mA

转膜时间：

60~90min

PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要， 曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：

皮细胞总蛋白

蛋白名称（可）：

occludin&AKT

蛋白分子量：

65KD&56KD

WB用膜类型、孔径：

0.45PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒压100V

转膜时间：

60~70min

设备名字是“Bio-Radmini”。

蛋白来源：

乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

65KD&55KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF（预先用甲醇处理）

转膜方式（恒压、恒流）：

半干转恒压12V

转膜时间：

30-40min

设备：

“Bio-Radmini”

建议：

最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：

293T细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

95KD&35KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。

转膜时间：

70min 

蛋白来源：

肿瘤手术标本

蛋白名称（可）：

转录因子

蛋白分子量：

33KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

350mA恒流

转膜时间：

150min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

说明：

相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何； 实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源：

成纤维细胞

蛋白名称（可）：

smad3

蛋白分子量：

54KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

350mA恒流

转膜时间：

150min

转膜设备：

湿转Bio-Rad 

蛋白来源：

胰腺癌细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

16KDaand42KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

120V恒压

转膜时间：

90min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

大鼠血管平滑肌细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

72KD，42KD和22KD

WB用膜类型、孔径：

一般的PVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转，恒流一膜0.26A，两膜0.3A。

转膜时间：

90min

设备：

“Bio-Radmini”

建议：

转膜缓冲液最多用3次，最好现用现配，我们用的没有加SDS，转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温，这样转的效果要好一些，转的时候一定要把治每层之间的气泡除去，同时使滤纸大于膜，膜大于胶，以免烧坏电极。

蛋白来源：

大鼠PBMC

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

55KD

WB用膜类型、孔径：

0.22的PVDF膜

转膜方式（恒流）：

湿转

转膜时间：

60-90min

设备：

“Bio-Radmini”

建议：

转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了  其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验，转膜时间、电压其实 也有很大围的调整，并不是非要固定于哪一个最合适，曾经做过  一膜转，17KD的和170KD的，按照170KD的条件，17KD的转膜也很好的。

蛋白来源：

人非小细胞肺癌细胞系

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

大于250kD

WB用膜类型、孔径：

milliporePVDF膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转，恒流0.3A。

转膜时间：

180min

设备：

“Bio-Rad”

建议：

电转保持电压在70V以上，保持低温，如果电压低过70就需要换缓冲液了。

蛋白来源：

白血病细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

28KD

WB用膜类型、孔径：

0.45的NC膜

转膜方式（恒流）：

湿转，90min，0.25A

设备：

“Bio-Rad”

建议：

海绵厚度要合适，一次转磨用的海绵太薄，导致治没夹紧，转膜后拿出来一看，marker都变得七扭八歪。

但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断，没经历过，不知道是不是会有这种情况。

蛋白来源：

肿瘤细胞

蛋白名称（可）：

磷酸化蛋白

蛋白分子量：

10-200KDa

WB用膜类型、孔径：

milliporePVDF膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

120v恒压

转膜时间：

120min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

建议：

转膜缓冲液只用2次，基本都转上，5%BSA封闭，减少背景。

蛋白来源：

胰腺β细胞

蛋白名称（可）：

******

蛋白分子量：

90-130KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

250mA恒流

转膜时间：

150min

转膜设备：

湿转

蛋白来源：

原核表达

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

38KD

WB用膜类型、孔径：

0.45NC

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒压：

100V

转膜时间：

120min

蛋白来源：

心脏

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

220kDa，130kDa，70kDa，41kDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

70v120min，180min，5-6h

转膜设备：

伯乐湿转

建议改进方向（可选）：

40kDa一下，70v，60-90min足够，40-70kDa90-120min即可。

70-120kDa，70v，120-180min足够，120-180kDa，180-240min，180kDa以上建议6h。

蛋白来源：

卵巢癌细胞膜蛋白

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

53KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

80V100min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

人宫颈癌HELA细胞总蛋白

蛋白名称（可）：

β-actin

蛋白分子量：

42

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

504h

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

脑组织

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

16KD、27KD、32KD、42KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF0.22um

转膜方式（恒压、恒流）：

半干转恒流1mA/cm2或2mA/cm2

转膜时间：

不定

转膜设备：

六一仪器

建议：

我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。

在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。

通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。

这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。

并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。

蛋白来源：

CHOcell

蛋白名称（可）：

酶原

蛋白分子量：

40KD

WB用膜类型、孔径：

0.22的PVDF膜（Biorad）

转膜方式（恒压）：

100V，湿转，转膜时间：

60min。

设备：

Tanon（天能）

建议：

1. 转膜液现用现配，用完倒掉。

2. 转膜时间，电压可以适当调整。

分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。

蛋白来源：

Hepg2

蛋白名称（可）：

EGFR

蛋白分子量：

170kd

WB用膜类型、孔径：

pvdf0.45

转膜方式（恒压、恒流）：

24V

转膜时间：

2个半小时

转膜设备：

伯乐半干转

蛋白来源：

肝癌细胞

蛋白名称：

HIF-1α

蛋白分子量：

120kD

WB用膜类型、孔径：

NC膜

转膜方式（恒压）：

80伏，湿转

转膜时间：

150分钟

设备：

“Bio-Radmini”

建议：

湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。

转膜均现配先用，不重复利用。

转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。

经春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。

该湿转条件自己做过的蛋白分子量围：

170-36kD。

蛋白来源：

心肌细胞总和膜

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

128KD，100，60，55，43KD

WB用膜类型、孔径：

NC膜0.2um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

70V200min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

建议：

转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70V电压下，电流约154mA。

甲醇可以加到150ml。

对大分子量如200KD转膜时间延长6-8h。

蛋白来源：

肺脏

蛋白名称（可）：

ICAM-1

蛋白分子量：

85~110KD

WB用膜类型、孔径：

0.22NC

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流300mA

转膜时间：

120min

设备名字Bio-Radmini

一抗用的santacruz1mL包装的。

比例调整到1：

800做出很好的条带。

 效价会一直降低的。

去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。

蛋白来源：

成纤维细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

16KDa

WB用膜类型、孔径：

0.2umPVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

0.2A恒流

转膜时间：

65min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

成纤维细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

28KDa

WB用膜类型、孔径：

0.2umPVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

0.25A恒流

转膜时间：

60min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

人肿瘤细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

80KD

WB用膜类型、孔径：

0.45umPVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

半干转移系统恒流，勿超过0.85mA/cm2，同时转多膜电流需累加（串联）

转膜时间：

60-90min

设备：

Bio-Rad

其实有些东西并不是非常严格的，要转移的目的蛋白分子量小，那么转移的时间就短一些，反之，则长一点；蛋白量充足，可以多转一会，蛋白量较少，则要少转一下，免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。

蛋白来源：

人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白

蛋白名称（可）：

***

蛋白分子量：

17--116kd

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流200mA

转膜时间：

3h

转膜设备：

湿转六一24Dmini

蛋白来源：

COCOS7293T

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

80725652482518KD

WB用膜类型、孔径：

0.45umPVDF膜

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转90V电流约为230--280mA之间。

两膜串联叠加。

转膜时间：

40min

设备：

Bio-Rad法码西亚

蛋白来源：

人肿瘤细胞

蛋白名称（可）：

磷酸化蛋白

蛋白分子量：

30-60KDa

WB用膜类型、孔径：

pallNC膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流0.85-1mA/平方厘米膜

转膜时间：

60-90min

转膜设备:

六一半干转

建议：

转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成2倍的母液，转膜液的多少会影响电转的效率，一般将吸水纸润湿即可，不要和膜一起浸泡，这样效果很好。

蛋白来源：

人肝癌肿瘤细胞

蛋白名称（可）：

notch

蛋白分子量：

60-120KDa

WB用膜类型、孔径：

pallNC膜0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流0.3A

转膜时间：

-20度冰柜120min

转膜设备:

湿转Bio-Rad

建议：

转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成10倍或5倍的母液，保持低温是转膜效果的一个保证，这样效果很好。

蛋白来源：

胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

18KDa、36KDa、55KDa、98KDa

WB用膜类型、孔径：

NC膜PALL

转膜方式（恒压、恒流）：

0.35恒流

转膜时间：

60min

转膜设备：

湿转Bio-Radmini

转缓液的配制有点讲究。

如果蛋白大于一百多，一般加入SDS，时间延长结果会更好些。

由于，目前试验的蛋白就都不大，所以，我们都采用不加SDS的转缓液，跑出来的条带也很整齐、干净。

蛋白来源大肠癌205

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

92kd，43kd

WB用膜类型、孔径：

0.45pvdf

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

90min

转膜设备：

湿转，天能。

蛋白来源：

大鼠脑组织

蛋白名称（可）：

BDNF（28KDa）、Bactin（42KDa）、LaminB（72KDa），以及磷酸化蛋白（43KDa）

WB用膜类型、孔径：

PVDF（0.45）膜

转膜方式（恒压、恒流）：

300mA恒流

转膜时间：

60min

转膜设备：

湿转Bio-RadMini

转膜缓冲液：

25％甲醛觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量，而且使膜对蛋白的吸附效果较好，Marker转到膜上很鲜艳。

用立春红染色效果也很好。

蛋白来源：

表达产物

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

29KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

0.3A恒流

转膜时间：

80min

转膜设备:

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

celllysate,culturemedium

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

15-50kD

WB用膜类型、孔径：

NC，PVDF，0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压，semi-dry

转膜时间：

about2hisokiftheproteinissmallandthevoltagecankeep100V，ifnotincreaseto3-4h。

转膜设备：

Bio-Rad

蛋白来源：

肺脏、肝脏等。

蛋白名称（可）：

actin

蛋白分子量：

43kD

WB用膜类型、孔径：

NC膜PALL0.22um

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流200mA

转膜时间：

45~60min

设备名字Bio-Radmini

用的santacruz分装和整装的都可以。

效价一般1：

1000-1：

3000左右，可稳定较长一段时间。

蛋白来源肺脏

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

19kd,35kd

WB用膜类型、孔径：

0.2pvdf

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流250

转膜时间：

150min

转膜设备：

湿转Bio-Radmini

蛋白来源：

大鼠血管

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

140kd

WB用膜类型、孔径：

0.45pvdf

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流，200mA

转膜时间：

210min

转膜设备:

湿转,六一

蛋白来源：

心肌

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

90kDa，70kDa,12.6kDa

WB用膜类型、孔径：

NC

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压

转膜时间：

70v240min，120min，60min

转膜设备：

伯乐湿转 

蛋白来源：

脑

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

16KD60KD

WB用膜类型、孔径：

16的用0.22的PVDF，60的用0.45的NC

转膜方式（恒压、恒流）：

20V

转膜时间：

16的30min，60的90min

转膜设备：

Bio-Rad半干

蛋白来源：

子宫膜癌组织

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

156.8

WB用膜类型、孔径：

NC膜

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流400mA

转膜时间：

90min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

真核表达

蛋白名称（可）：

（多种，30个以上）

蛋白分子量：

40-200kD

WB用膜类型、孔径：

PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压100V（电流在280mA至350mA之间）

转膜时间：

60min（M<100kD）,60-100min（100kD

转膜设备：

湿转

蛋白来源：

大鼠肾脏

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

130kD

WB用膜类型、孔径：

0.45NC膜PALL

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流350mA

转膜时间：

120min

设备名字Bio-Radmini

一抗用的sigma羊抗大鼠，0.2mL包装的，打折后价格3000多，有些贵哦。

比例调整到1：

1500左右条带可，用BSA封闭。

但是背景稍高。

蛋白来源：

脑组织

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

38KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜，

转膜方式（恒压、恒流）：

80v恒压

转膜时间：

180min

转膜设备：

湿转Bio-Radmini

蛋白来源：

真核表达

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

约35kD（双亚基）

WB用膜类型、孔径：

0.22umPVDF

转膜方式（恒压、恒流）：

恒流200mA

转膜时间：

60min

转膜设备：

湿转Bio-rad,天能，六一

转膜时间其实不需要那么长的，转膜没转上一般原因不在这里，可能是转膜液的原因：

有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合，还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的抗体不结合（这是我最近的经验教训），还有一抗的选择很重要，一定要选识别线性表位的抗体，才能用于做WB。

蛋白来源：

细菌蛋白

蛋白名称（可）：

全部的可溶性蛋白

蛋白分子量：

11-170KD

WB用膜类型、孔径：

0.45NC

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流300mA

转膜时间：

80min

蛋白来源：

骨肉瘤细胞

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

72kDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜（0.45um）

转膜方式（恒压、恒流）：

半干转恒流200mA

转膜时间：

20-30min

转膜设备：

Bio-Rad型号忘了，就是有4个插孔的电泳仪。

建议改进方向：

低温很重要，新鲜的电转液也很重要。

蛋白来源：

骨肉瘤CELLLINE

蛋白名称（可）：

Betaactin

蛋白分子量：

42kDa

WB用膜类型、孔径：

NitrocelluloseMembrane0.2umPoreSize（Invitrogen）

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转，恒压22v

转膜时间：

90min

转膜设备：

X-cellSureLockMini-cell（Invitrogen）

建议改进方向：

转膜过程冰水浴，保持低温，TransferBuffer重复使用。

蛋白来源：

肾瘤细胞

蛋白分子量：

39kDa

WB用膜类型、孔径：

NitrocelluloseMembrane0.2umPoreSize（Invitrogen）

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒压100v

转膜时间：

50min

蛋白来源：

MCF7

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

70kDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜（GE）

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转100伏

转膜时间：

60min

转膜设备：

伯乐小转膜仪

蛋白来源：

pichia分泌表达

蛋白名称（可）：

细胞因子等

蛋白分子量：

17到30kDa

WB用膜类型、孔径：

milliporePVDF0.45um

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒压：

100V

转膜时间：

60min

这个条件除了100KDa的预染maker转的不好，剩下的条带都非常清晰。

正向前面ycwzq说的，感觉时间不是很重要，只要蛋白别太小或太大，在一个比较宽的时间和电压围都能转上。

当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。

所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上，便于分析交流。

我先说我的吧，是大师兄师姐的配方，我用了感觉还不错，但是100KDa以上的转的不好。

蛋白转印缓冲液pH8.2:

Tris碱1.93g，甘氨酸9g，甲醇200ml，加水定容至1000ml。

蛋白来源：

大鼠坐骨神经

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

30kDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜（0.2um）

转膜方式（恒压、恒流）：

湿转恒流300mA

转膜时间：

45min

转膜设备:

Bio-Rad

蛋白来源：

小鼠胚胎成纤维

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

36KDa、55KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45

转膜方式（恒压、恒流）：

0.3A恒流

转膜时间：

60min

转膜设备:

湿转Bio-Radmini

垫子变薄时，可用三层纤维垫，也没问题。

蛋白来源：

小鼠前列腺癌细胞

蛋白名称（可）：

P53P21RAD51GAPDH

蛋白分子量：

53KDa、21KDa、37KDa、36KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压110v

转膜时间：

60min

转膜设备:

湿转Bio-Radmini

蛋白来源：

HEK293总蛋白

蛋白名称（可）：

***

蛋白分子量：

~200KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.2um（用甲醇预先处理）

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压25V

转膜时间：

过夜（~16-20hours）

转膜设备:

bioradmini

蛋白来源：

人前列腺癌细胞

蛋白名称（可）：

***

蛋白分子量：

~40KD

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜0.45um（用甲醇预先处理）

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压20V，限制最高电流0.3A。

转膜时间：

过夜（~16-20hours）

转膜设备：

bioradsemi-dry

蛋白来源：

组织

蛋白名称（可）

蛋白分子量：

42KDa

WB用膜类型、孔径：

PVDF膜（0.22）

转膜方式（恒压、恒流）：

350mA恒流

转膜时间：

60-90min

转膜设备：

湿转Bio-Rad

蛋白来源：

E.ColiBL21

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

4kd

WB用膜类型、孔径：

PVDF0.22um

转膜方式（恒压、恒流）：

恒压15v

转膜时间：

O/N

转膜设备:

Bio-RadMini湿转

转膜液的配制：

for1Ltransferbuffer，200mlMethanol，14.4gGlycine，3.03gTrizma-base。

用了Trcine-gelSDSPage，效果不错

蛋白来源：

肾脏

蛋白名称（可）：

蛋白分子量：

23kd

WB用膜类型、孔径：

PVDF0.45