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6掩蔽剂:
称取30.00g硫酸汞溶解于100ml10%的硫酸中。
710%的硫酸:
取50mL蒸馏水,缓慢加入10ml的浓硫酸,冷却后定容至100mL。
(2)挥发酸(VFA,VolatileFattyAcid)的测定
1、取离心水样0.5ml,向其中加入1.7ml的硫酸乙二醇(1.5ml乙二醇和0.2ml(1:
1硫酸)),混合均匀后将其放入沸水中加热3min,之后待其冷却后向其中加入2.5ml的羟胺溶液,混合均匀后静止1min,然后全部置于10ml酸性氯化铁的容量瓶中,定容至25ml,静止5min后在分光光度上测其值,波长定为500nm。
标准曲线:
99.6%。
同样操作做空白试验1份。
硫酸乙二醇:
乙二醇15ml
1+1的硫酸2ml
羟胺溶液:
4.5mol/L的氢氧化钠20ml
10%硫酸羟胺溶液5ml
酸性氯化铁:
称取20g的六水氯化铁于500ml的烧杯中,向其中加入蒸馏水,准确量取20ml的浓硫酸于其中,充分搅拌,加蒸馏水定容至1L。
10%硫酸羟胺溶液:
称取硫酸羟胺10g,溶于100ml蒸馏水中。
(3)碱度的测定
1、水样离心10min。
2、取样
V2ml水样+30V2ml蒸馏水+3滴溴甲酚绿—甲基红指示剂+1滴硫代硫酸钠
3、滴定
用0.02mol/L的标准盐酸溶液滴定,颜色由无色转为淡红色,即为滴定终点,记录样品中消耗的盐酸用量为V1ml,空白对照中消耗的盐酸用量为V0ml。
碱度=
×
1000(mmol/L)
式中:
V1——样品消耗的盐酸量;
V0—空白溶液消耗的盐酸的量;
V2——水样体积。
1蒸馏水:
应煮沸加热15min去除水中溶解的二氧化碳,冷却后备用。
2溴甲酚绿-甲基红指示剂:
取100mg的溴甲酚绿钠盐和20mg甲基红钠盐溶于100ml蒸馏水中即可。
或称取100mg的溴甲酚绿和20mg甲基红溶于100ml95%的乙醇中。
30.02mol/L的盐酸标准溶液:
相对密度为1.19的浓盐酸8.3ml,以蒸馏水定容至1000ml,即为0.10mol/L的盐酸溶液,储存备用。
使用时,取200ml以蒸馏水定容至1000ml,即为0.02mol/L的盐酸溶液,其准确浓度需以0.0200mol/L的基准碳酸钠溶液标定。
40.1mol/L(1/2Na2S2O3)溶液:
称12.5gNa2S2O3·
5H2O,溶于1000mL新煮沸并已放冷的水中,此溶液浓度约为0.1mol/L,加入0.2g无水碳酸钠,贮于棕色瓶内。
(4)水中氨氮的测定(纳氏试剂比色法)
一、原理
碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物,其色度与氨氮含量成正比,通常可在波长410—425nm范围内测其吸光度,计算其含量。
本法最低检出浓度为0.025mg/L(光度法),测定上限为2mg/L。
二、仪器
1.500mL全玻璃蒸馏器。
2.50mL具塞比色管。
3.分光光度计。
4.pH计。
三、试剂
配制试剂用水均应为无氨水。
1.无氨水:
可用一般纯水通过强酸性阳离子交换树脂或加硫酸和高锰酸钾后,重蒸馏得到。
2.1mol/L氢氧化钠溶液。
3.吸收液:
①硼酸溶液:
称取20g硼酸溶于水中,稀释至1L。
②0.01mol/L硫酸溶液。
4.纳氏试剂:
称取16g氢氧化钠,溶于50mL水中,充分冷却至室温。
另称取7g碘化钾和碘化汞(HgI2)溶于水,然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中。
用水稀释至100mL,贮于聚乙烯瓶中,密塞保存。
5.酒石酸钾钠溶液:
称取50g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·
4H2O)溶于100mL水中,加热煮沸以除去氨,放冷,定容至100mL。
6.铵标准贮备溶液:
称取3.819g经100℃干燥过的氯化铵(NH4Cl)溶于水中,移入1000mL容量瓶中,稀释至标线。
此溶液每毫升含1.00mg氨氮。
7.铵标准使用溶液:
移取5.00mL铵标准贮备液于500mL容量瓶中,用水稀释至标线。
此溶液每毫升含0.010mg氨氮。
四、测定步骤
1.水样预处理:
无色澄清的水样可直接测定;
色度、浑浊度较高和含干扰物质较多的水样,需经过蒸馏或混凝沉淀等预处理步骤。
2.标准曲线的绘制:
吸取0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00和10.0mL铵标准使用液于50mL比色管中,加水至标线,加1.0mL酒石酸钾钠溶液,混匀。
加1.5mL纳氏试剂,混匀。
放置10min后,在波长420nm处,用光程10mm比色皿,以水为参比,测定吸光度。
由测得的吸光度,减去零浓度空白管的吸光度后,得到校正吸光度,绘制以氨氮含量(mg)对校正吸光度的标准曲线。
3.水样的测定:
分取适量的水样(使氨氮含量不超过0.1mg),加入50mL比色管中,稀释至标线,加1.0mL酒石酸钾钠溶液(经蒸馏预处理过的水样,水样及标准管中均不加此试剂),混匀,加1.5mL的纳氏试剂,混匀,放置10min。
4.空白试验:
以无氨水代替水样,作全程序空白测定。
五、计算
由水样测得的吸光度减去空白实验的吸光度后,从标准曲线上查得氨氮含量(mg)。
氨氮(N,mg/L)=m×
1000/V
m——由校准曲线查得样品管的氨氮含量(mg);
V——水样体积(mL)。
注意事项
1、纳氏试剂中碘化汞与碘化钾的比例,对显色反应的灵敏度有较大影响。
静置后生成的沉淀应除去。
2、滤纸中常含痕量铵盐,使用时注意用无氨水洗涤。
所用玻璃器皿应避免实验室空气中氨的沾污。
(5)总磷的测定(法)
1主题内容与适用范围
本标准规定了用过硫酸钾为氧化剂,将未经过滤的水样消解,用钼酸铵分光光度测定总磷的方法。
总磷包括溶解的、颗粒的、有机的和无机磷。
本标准适用于地面水、污水和工业废水。
2原理
在中性条件下用过硫酸钾使试样消解,将所含磷全部转化为正磷酸盐。
在酸性介质中,正磷酸盐与钼酸铵反应,在锑盐存在下生成磷杂多酸后,立即被抗坏血酸还原,生成蓝色的络合物。
3仪器及用具
具塞(磨口)比色管:
50mL;
加热板;
刻度吸管:
5mL,2mL,1mL;
紫外分光光度计;
烧杯:
1000mL
4试剂
本标准所列试剂除磷酸二氢钾为工作基准试剂外,其余均为分析纯,水为蒸馏水。
4.1过硫酸钾溶液:
50g/L。
将25g过硫酸钾溶于水并稀释至500mL。
4.2钼酸铵溶液:
26g/L。
称取13g钼酸铵,精确至0.1g。
称取0.35g酒石酸锑钾,精确至0.01g。
溶于在200mL水中,加入300mL硫酸溶液,混匀,冷却后用水稀释至500mL,混匀,存于棕色试剂瓶中(冷藏可保存两个月)。
4.3抗坏血酸溶液:
100g/L。
称取50g抗坏血酸,精确至0.1g。
溶于蒸馏水中,用水稀释至500mL,贮于棕色试剂瓶中(冷藏可稳定几周,如不变色可长时间使用)。
4.4磷标准贮备溶液:
1mg/mL。
溶解磷酸二氢钾(使用前在105℃下干燥2h)1.0967g于蒸馏水中,移入250mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。
4.5磷标准工作溶液:
10ug/mL。
吸取5mL磷标准储备溶液于500mL容量瓶中,以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。
5分析步骤
5.1空白试样
按(5.2)的规定进行空白试验,用水代替试样,并加入与测定时同体积的试剂。
5.2测定
5.2.1消解
吸取5mL混匀水样于50mL具塞比色管中,加入5mL过硫酸钾溶液(4.1),用蒸馏水稀释至25mL,将比色管置于沸水浴中加热30分钟,取出冷却至室温。
5.2.2发色
分别向各份消解液中加入1mL抗坏血酸溶液(4.3),2mL钼酸铵溶液(4.2),用蒸馏水稀释至50mL,充分混合均匀。
5.2.3分光光度测量
室温下放置30分钟后,使用光程为10mm比色皿,在700nm波长下,以蒸馏水为参比液,空白试液调节零点,测定吸光度后,从工作曲线(5.2.4)上查得磷的含量。
5.2.4工作曲线的绘制
取6支具塞比色管分别加入0.0;
0.50;
1.0;
2.0;
3.0;
4.0mL磷标准溶液(4.5)。
然后按步骤(5.2)进行处理,以蒸馏水为参比液,空白试液调节零点,测定吸光度后,和对应的磷的含量绘制工作曲线。
6计算
总磷含量以C(mg/L)表示,按下式计算:
m×
X
C=--------
V
m----试样测得含磷量,ug;
X---样品稀释倍数;
V----测定用试样体积,mL。
注:
1、对于总磷较大的水样(如精炼厂、榨油厂污水和中和水)需将水样稀释50倍后再进行检测;
排放水采样量为10mL。
2、若消解后的试样有悬浮物需过滤后再发色。
(6)溶解性糖的测定(苯酚-硫酸法)
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
原理
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物。
试剂
1.浓硫酸:
分析纯,95.5%
2.80%苯酚:
80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。
3.6%苯酚:
临用前以80%苯酚配制。
(每次测定均需现配)
4.标准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析纯葡萄糖。
操作
1.制作标准曲线:
准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线。
2.样品含量测定:
吸取样品液1.0ml(相当于40ug左右的多糖),按上述步骤操作,测光密度,以标准曲线计算多糖含量。
注意
(1)此法简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅制作一条标准曲线,颜色持久。
(2)制作标准线宜用相应的标准多糖,如用葡萄糖,应以校正系数0.9校正μg数。
(3)对杂多糖,分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
(4)测定时根据光密度值确定取样的量。
光密度值最好在0.1——0.3之间。
比如:
小于0.1之下可以考虑取样品时取2克,仍取0.2ml样品液,如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
(7)溶解性蛋白的测定
(一)样品
(二)试剂
1.牛血清白蛋白标准液(200g/ml)
准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg,用0.1mol/LNaOH溶液润湿溶解,加蒸馏水到250ml。
2.碱性硫酸铜溶液
①碱溶液:
Na2CO32g溶于100ml0.1mol/LNaOH中。
②硫酸铜溶液:
CuSO4∙5H2O0.5g溶于100ml35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。
使用前将①与②按50:
1混合即成碱性硫酸铜溶液。
使用时新鲜配制。
3.Folin-酚试剂
在2L磨口回流装置内加钨酸钠(Na2WO4∙2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)25g,蒸馏水700ml,14.68mol/L(85%)磷酸50ml,浓盐酸100ml,充分混合后用小火回流10h。
冷却后,再加硫酸锂(Li2SO4∙H2O)150g,水50ml,数滴(2~3滴)液体溴(也可用30%H2O26~8滴代替),然后开口沸腾15min,驱除过量的溴(因溴气甚毒,这一步应在通风橱中进行),冷却后加水至1000ml,过滤,溶液呈黄色(如带绿色则不能用),保存于棕色瓶中置冷暗处备用(如配制时间较长,试剂转呈绿色),可再加液体溴数滴,煮沸15min,若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用)。
(三)仪器及器材
1.V-1100分光光度计
2.恒温水浴箱
3.试管6支、试管架
4.加样枪、加样枪架
5.坐标纸
三、实验步骤
(一)操作步骤
1.反应体系设置
取6支试管编号,按下表加入试剂,混匀。
试剂(mL)
空白管
标准管
样品管
1
2
3
4
5
6
牛血清白蛋白标准液
0.2
0.4
0.6
0.8
样品液
0.5
蒸馏水
1.0
2.双缩脲反应
向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2ml,混匀,室温放置10min。
3.Folin-酚反应
再加入Folin-酚试剂0.20ml,2s内迅速混匀a!
40℃水浴10min后,冷却至室温。
a.当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后,必须立即混匀(加一管混匀一管),使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
b.每管重复测三次A500值,求平均值用于绘标准曲线。
4.比色测定
以500nm波长比色,用1号管作空白,读取各管吸光度值A500b。
(二)注意事项
1.干扰物质
此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂,因此凡干扰双缩脲反应的基团,如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂,如Tris缓冲剂以及蔗糖,硫酸铵,巯基化合物均可干扰Folin-酚反应。
此外,所测的蛋白质样品中,若含有酚类及柠檬酸,均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素(约0.5%左右),胍(0.5%左右),硫酸钠(1%),硝酸钠(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)对显色无影响,这些物质在所测样品中含量较高时,则需做校正曲线。
若所测的样品中含硫酸铵,则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。
若样品酸度较高,也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍,这样即可纠正显色后色浅的弊病。
2.控制时间
因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间。
即第1支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂,2分钟后加第3支试管,以此类推。
全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟,则第1支试管可立即加入0.20mlFolin-酚试剂,1分钟后第2支试管加入0.20mlFolin-酚试剂,2分钟后加第3支试管,以此类推。
40℃水浴10min,冷却后,每一分钟测定一管吸光值。
四、结果与讨论
(一)结果
1.数据记录
按照下表记录各管在500nm波长测得的吸光度值。
测定次数
各管吸光度值A500
各管平均值
2.绘制标准曲线
(1)选择合适的坐标纸
(2)画坐标轴:
以A500值为纵坐标,牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标。
(3)根据测得的数据描点
(4)连线:
根据所描点的分布情况,作过原点的直线或光滑连续的曲线,该线表示实验点的平均变动情况,因此该线不需全部通过各点,但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。
(5)求实验结果
3.结果计算
根据未知样品溶液的吸光度值,在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
然后乘以稀释倍数(300),得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数,即每毫升血清中蛋白质的微克数(g/ml)。
血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度×
2×
300
参考:
正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L。
4.常见问题及处理
问题
解析
(1)加入Folin-酚试剂后溶液呈现黄绿色
加入Folin-酚试剂后没有及时混匀或加入的量不准确,偏多
(2)水浴后溶液呈无色
Folin-酚试剂在反应前已被破坏,原因是加入Folin-酚试剂后没有及时混匀,或水浴时间过长。
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