病毒包装实验整体流程及原理.docx

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病毒包装实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验整体流程及原理

目基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用手段是将目基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒种类

病毒有很多种，常见有慢病毒和腺病毒

1.1慢病毒

1.1.1原理

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒一种。

构建siRNA/miRNA慢病毒载体，和化学合成siRNA和基于瞬时表达载体构建普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞基因组，进行长时间稳定表达。

1.1.2特点

1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难以转染细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：

1）含有目基因慢病毒RNAi干扰载体构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒上清培养液。

4）病毒纯化和浓缩。

5）分装、-80℃保存。

6）滴度测定目基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒

1.2.1原理

腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因方式取代E1和E3基因，降低病毒复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因细胞中复制，因此是一种适用于治疗高效控制系统。

1.2.2特点

1）几乎可以感染所有类型细胞

2）可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）腺病毒

3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效进行增殖。

4）腺病毒载体感染宿主范围比较广，制备容易，操作简单.

5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。

1.2.3腺病毒包装简要流程

1）构建表达siRNA/miRNA腺病毒载体

2）采用PacI消化纯化质粒。

3）消化好腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。

5）分装，-80℃保存。

1.3、慢病毒和腺病毒比较

慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较

病毒表达系统

慢病毒表达系统（Lentivirus）

腺病毒表达系统（Adenovirus）

病毒基因组

RNA病毒

双链DNA病毒

复制

自主复制

自主复制

是否整合

病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因

病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因

感染细胞类型

感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染原代细胞（如神经细胞）及体内实验

感染分裂和不分裂细胞

表达丰度

中水平表达

高水平表达

表达时间

慢（1-3天）

快（1-2天）

滴度

滴度最高可达10*8pfU/ml

滴度最高可达10*11pfU/ml

克隆容量

可插入不超过8kb外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低

可插入高达8kb外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低

免疫原性

低免疫原性

高免疫原性

2、构建目基因到载体

2.1构建手段

一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。

1）如果原始质粒和载体有匹配酶切位点，采用相应内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定

2）如果没有匹配酶切位点，则设计带有特殊接头引物进行PCR扩增，得到目片段，采用相应内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定

2.2质粒载体

2.2.1概念

能够进行自主复制环状DNA双链结构，包括真核生物细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外环状脱氧核糖核酸（DNA）分子

2.2.2特征

质粒上常有抗生素抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体（episome），这类质粒能够整合进真菌染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外DNA分子。

质粒在宿主细胞体内外都可复制。

通过这些特性，人们可以把一些目DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断复制，来得到目产物。

3、质粒DNA在大肠杆菌里转化

连接上目基因质粒转化大肠杆菌是为了让目基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化三步骤。

3.1大肠杆菌感受态细胞制备

1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基试管中，37℃振荡培养过夜。

2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h

3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min

4）4℃离心10min（4000r/min）

5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽

6）用冰浴0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min

7）4℃离心10min（4000r/min）

8）倒出上清液，用冰浴0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）

9）分装细胞，200ul一份，4℃保存

3.2质粒DNA转化

1）取200ul新鲜制备感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min

2）离心管放到42℃保温90s

3）冰浴2min

4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）

5）取适当体积（100ul）复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min

6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落

3.3质粒提取步骤

1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜菌液，12000转离心1min，弃上清

2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。

3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔反复颠倒混匀5-6次。

室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清裂解溶液。

4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。

5）12000室温离心10min，收集上清。

6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。

7）12000转离心1min，弃滤液。

8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目是将硅胶膜上吸附蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。

10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留液体。

11）将DNA纯化柱置于新离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。

12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度质粒DNA，质粒于-20℃保存。

质粒提取步骤：

吸取液体培养基于1.5ml离心管中12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min——取上清液转移到专用制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回2ml离心管12000转离心1min——将制备管移入新1.5ml离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒离心管于4℃或是-20℃保存

4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）

4.1名词解释

4.1.1293T细胞是由293细胞派生,表达SV40大T抗原人肾上皮细胞系,被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白,或是用以包装病毒。

4.1.2脂质体：

某些细胞质中天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。

4.2共转染操作步骤

第一天：

用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。

确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度

第二天：

1.500ul无血清培养基稀释2ug表达质粒+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G

2.500ul无血清培养基稀释15ul脂质体2000

3.5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min

4.从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。

5.6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。

第三天：

1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上

第四天：

1.转染后48和72h分别收获含病毒上清。

2.3000rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。

3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。

4.滴度测定目基因检定，并出具检测报告。

4.3病毒包装原理

质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒外壳及蛋白成分载体质粒，其同时连有目基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出目基因RNA和psPAX2、pMD2.G基因翻译出蛋白组装为慢病毒。

在上述程序中提及“第四天”收集病毒。

在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目基因却不能表达出病毒外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害并且高效将目基因转然到靶细胞基因组中。

5、慢病毒感染细胞

5.1流程图

5.2感染步骤

1）铺板：

将对数生长期细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜

2）感染：

将70-80%铺满12孔板中培养液吸除，换新鲜培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。

3）24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。

5.3荧光显微镜操作流程

打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。

图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。

（针对leica）

5.4注意事项内容

1.病毒浓度要适宜，太少话细胞被感染也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。

2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。

3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。

4.在加病毒后一般24h