植物总DNA的提取Word文档下载推荐.docx

植物总DNA的提取Word文档下载推荐.docx

《植物总DNA的提取Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物总DNA的提取Word文档下载推荐.docx（27页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巯基乙醇

2、TE缓冲液（pH8.0）

10mmol/LTris·

HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-异戊醇混合液（24：

1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[实验步骤]

1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

）

7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。

沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。

边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]

1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

2、液氮研磨的原理是什么？

实验2质粒DNA的提取和酶切

质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。

质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。

由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

限制性内切酶（Restrictionenzyme，RE）是在细菌内发现的细菌降解外来DNA的保护机制。

由于限制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。

不同的限制性内切酶识别的序列不同。

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

限制性内切酶通过识别特定的DNA序列并在特定序列的特定位点打开磷酸酯键。

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

5、Tip头、Eppendorg管

6、含有目的质粒的E.coli菌株

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

1mmol/LEDTA（pH8.0）

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6、EcoRI及其缓冲液

7、HindIII及其缓冲液

[实验步骤]

1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。

12000r/min离心5min。

倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

13、取4μL所提取的质粒DNA，加入1μL酶切缓冲液，EcoRI或HindIII1μL，用超纯水补至总体积10μL。

37℃保温2h以上。

14、酶切样品待琼脂糖电泳检测。

操作时，避免剧烈震荡。

1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

2、SDS和NaOH的作用是什么？

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

图pBluescriptIISK质粒载体

实验3PCR基因扩增

　PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明的聚合酶链反应。

这一技术具有划时代意义的。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。

多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1、变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：

使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3、延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

1、PCR热循环仪

2、tip头、冰盒

3、PCR管

4、超纯水

5、DNA相对分子质量标准物

6、移液枪

1、10×

缓冲液

500mmol/lKCl

100mmol/lTris·HCl（pH8.3,室温）

15mmol/lMgCl2

0.1%明胶

2、4×

dNTP

1mmol/ldATP

1mmol/ldCTP

1mmol/ldGTP

1mmol/ldTTP

3、Taq酶5U/μL

4、DNA模板1ng/μL

5、引物1、引物2

引物溶液浓度10pmol/μl

1、在PCR管内配制20μL反应体系：

反应物体积/μL

10×

buffer2.0

dNTP1.0

引物11.0

引物21.0

Taq酶0.5

Template1

ddH2O13.5

总体积20

2、按下列程序进行扩增：

①、95℃预变性5min

②、95℃变性1min

③、55℃退火1min

④、72℃延伸1min

⑤、重复步骤②~④30次；

⑥、72℃延伸10min

3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。

保持电流40mA。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。

3、取样时注意不要污染药品。

1、什么是引物二聚体？

出现引物二聚体的原因是什么？

2、PCR仪的热盖设置有什么优点？

1、《PCR技术操作和应用指南》主编林万明人民军医出版社1995年

2、《PCR技术实验指南》[美]C.W.迪芬巴赫G.S.德维克斯勒科学出版社2003年

实验4琼脂糖凝胶电泳检测DNA

琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖-3,6-L半乳糖。

许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。

该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。

在pH4.0-9.0的缓冲液中稳定。

由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。

在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。

学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA, 

简称LDNA）。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、凝胶成像系统

3、DNAmarker

4、检测样品

5、琼脂糖

1、5×

TBE（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml5×

TBE：

Tris54g

硼酸27.5g

0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）

2、凝胶加样缓冲液（6×

溴酚蓝0.25%

蔗糖40%

3、溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml

（一）制备琼脂糖凝胶

1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb

0.35~60

0.61~20

0.70.8~10

0.90.5~7

1.20.4~6

1.50.2~4

2.00.1~3

2、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×

TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。

（二）胶板的制备

1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2、有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3、将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。

5、加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。

（三）加样

用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:

5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，染色30min。

4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。

因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。

实验5聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。

2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。

单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED作为催化剂，以APS作为引发剂。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所占比重越大，凝胶的网孔就越小。

CH2=CH

—CH2—CH—

CH2—CH—

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素：

蛋白质所带静电荷：

在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。

在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。

其次，蛋白质的形状和大小：

蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。

蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。

在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。

电压x样品静电荷

迁移率= 

摩擦力

浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。

浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。

它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。

另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。

浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH6.7）,该pH远低于Tris的pK值（8.1）。

分离胶内的缓冲溶液是pH8.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。

在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。

由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。

当样品进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。

样品缓冲溶液

Tris/HClpH6.7

Tris/甘氨酸pH8.9

-

+

分离胶

Tris/HClpH8.9

浓缩胶

Tris/HClpH6.7

[实验材料]

1.实验器材

Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型电泳仪；

电源（电压200V，电流500mA）；

100℃沸水浴；

Eppendorf管；

微量注射器（50μl或100μl）；

带盖的玻璃或塑料小容器；

摇床。

2.实验试剂

试剂号

配方

pH

1

分离胶缓冲溶液1mol/LHCl48.0ml

三羟甲基氨基甲烷36.3g

加蒸馏水到100ml

8.9

2

单体交联剂丙烯酰胺（Acr）30g

甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g

3

过硫酸铵100mg/ml

4

四甲基乙二胺（TEMED）

5

浓缩胶缓冲溶液1mol/LHCl48ml

三羟甲基氨基甲烷5.89g

加蒸馏水到100ml

6.7

6

电极缓冲溶液甘氨酸28.8g

三羟甲基氨基甲烷6.0g

加蒸馏水到1000ml,用前稀释10倍

8.3

7

染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸馏水到100ml

8

示踪染料溴酚蓝0.05g溶于100ml蒸馏水

9

样品：

蛇毒干粉200mg溶于20ml,pH6.7缓冲溶液（5）中，再加入25%蔗糖20ml和溴酚蓝（8）10ml

凝胶溶液的配方

试剂

分离胶（ml）

浓缩胶（ml）

蒸馏水

1.25

2.5

6.195

0.05

0.005

1.0

7.64

0.10

总体积（ml）

10

Aa浓度（g%）

7.5

3.0

[实验操作]

1.凝胶柱的制备

取l0cm×

0.6cm的玻璃管，选择较平整的一端为底端，量取7.5cm、8cm两处，画线；

底端管口用小块胶布封口，插入橡皮垫中，垂直放置于试管架中。

用巴斯德滴管吸取分离胶，缓慢贴壁加胶到管内7.5cm处，立即加蒸馏水至8cm处。

待分离胶凝固后，将胶面上的水分甩掉，残留的水分用滤纸条吸干，用滴管速加浓缩胶到分离胶面上至8cm处，再小心地加一层覆盖水。

2.安装电泳槽

选择无气泡、无裂缝、长度合适的小玻璃管，撕掉胶布，安装到电泳仪上，注意要紧密，以防止上槽缓冲溶液漏液；

向下槽注入电极缓冲液，注意用弯头滴管除去玻璃管下端的气泡；

再向上槽倒入电极缓冲液淹没小管，同样用滴管除去气泡。

3.加样

用微量注射器取样品液30μl，沿壁加在浓缩胶面上，注入时要慢，避免激起电极缓冲液。

4.电泳

连接电极，上槽与负极相连，下槽与正极相连；

调节电流为lmA／管，待示踪染料进入分离胶时调节电流为2mA／管，待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源，电泳时间为2小时~3小时。

5.剥胶

取下凝胶管，用局麻针头注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分开，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于编号的试管内，用蒸馏水冲洗几次。

6.染色

将考马斯亮蓝染色剂倒入放有胶条的小试管中，没过胶条；

60℃水浴保温40分钟~50分钟后取出，用水冲洗2次~3次，观察结果。

[实验结果]

观察凝胶条中的蛋白质与考马斯亮蓝染色剂结合后所形成的蓝色复合物，并通过画图记录结果。

⒈聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子的基本原理？

⒉样品液中加入蔗糖和溴酚蓝的目的是什么？

实验6DNA重组

用T4DNA连接酶将载体pBR322EcoRⅠ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoRⅠ片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。

（一）DNA连接酶的作用步骤

1．T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物（腺苷酰酶）

2．酶－AMP复合物再结合到具有5´

-磷酸基和3´

-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

3．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

（二）DNA的连接方式

在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。

连接的方式有：

1．自连

2．两种片段相连

3．三个片段以上的自连与互连

（三）连接反应的条件

1．缓冲液：

一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2＋、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。

BSA（小牛血清蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。

2．温度：

连接反应温度在