分子生物学技术综合实验讲义Word下载.docx
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1.小型高速离心机
2.恒温摇床
3.恒温箱
4.-20℃冰箱
5.恒温水浴器
(二)材料
1.卡那霉素或氨苄霉素
2.大肠杆菌DH5
3.质粒DNA(Kan抗性)
4.1.5l离心管
5.移液枪、枪头
6.试管、培养皿
(三)试剂
1.LB培养液
在950ml去离子水中加入:
胰蛋白胨(tryptone)
10g
酵母提取物(yeastextract)
5g
NaCl
摇动容器直至溶质完全溶解,用Na0H调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
2.卡那霉素(Kan),用无菌水配制成100mg/ml溶液,置-20℃冰箱保存。
3.CaCl2溶液
100mMCaCl2
4.CaCl2-甘油溶液:
20~25%甘油
[实验步骤]
感受态制备:
1.挑取E.ColiDH5单菌落接种于5ml液体LB培养基中,37℃培养过夜。
2.取500l菌液加到50mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h,至O.D.为0.3-0.5,冰浴30min。
3.4,000×
g,4℃离心3min,收集菌体。
4.用预冷的10mlCaCl2溶液悬浮菌体,冰浴20~30min。
5.4,000×
g4℃离心3min收集菌体,用预冷的2mlCaCl2-甘油溶液重悬。
6.置于冰浴中备用(12~24h内转化效率最高),以每管200μl
7.分装于1.5ml离心管中,液氮速冻后,-70℃保存备用。
转化
1.新鲜制备的或-20℃下保存的200l感受态细胞,置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2.加入1L质粒DNA,轻轻混匀。
3.冰上放置30分钟。
4.42℃水浴热激60秒。
5.冰上放置2分钟。
6.加800lLB培养液,37℃250rpm/分振荡培养30分钟。
7.室温下4000rpm离心5分钟,用枪头吸掉800l上清液。
8.重悬后,吸取50l细菌液涂布在Kan/LB琼脂平板上。
9.平皿在37℃下正向放置1小时,待接种的液体吸收进琼脂后,将平皿倒置,培养过夜。
10.对照的制作:
在上述步骤中不加入质粒DNA,其它步骤操作相同。
[实验结果]
经37℃培养过夜的、在卡那霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为质粒DNA转化的大肠杆菌。
计数菌落总数,计算制备的感受态菌的转化效率,以每g质粒DNA转化的菌落数表示。
实验二质粒DNA的提取
[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后,共价闭合环状的质粒DNA两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。
1.恒温培养箱
3.小型高速离心机
4.高压灭菌锅
1.转化有质粒DNA的大肠杆菌
2.1.5l离心管
3.移液枪、枪头
SolutionI
50mM葡萄糖
25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·
HCl(pH8.0)
10mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
SolutionII
0.4M/LNa0H,2%SDS(十二烷基硫酸钠),用前等体积混合
SolutionIII(钾离子浓度3M,乙酸根离子浓度5M)
5M乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
pH4.8
TE缓冲液(pH8.0)
10mMTris·
HCl
1mMEDTA
RNaseA
将RNaseA酶溶于TE缓冲液中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15min灭活DNA酶活性,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
1.挑单菌于带有适当抗生素的LB液体培养基中,摇菌过夜,至OD值0.6~0.8
2.取1~1.5ml(具体体积视菌体的浓度和质粒的拷贝数而定)菌液于1.5mlependorf管中,12,000g,离心30s,弃尽上清,收集菌丝体
3.加入溶液Ⅰ200l,漩涡振荡器振荡,重悬菌丝体
4.加入溶液Ⅱ200l,轻轻颠倒ependorf管4~5次,使溶液充分混匀,此时可以观察溶液重新变得清亮,置于冰上
5.加入溶液Ⅲ200l,轻轻颠倒ependorf管4~5次,使溶液充分混匀,此时可以观察溶液产生絮状沉淀,置于冰上15min
6.12,000g,4℃,离心15min
7.吸取上清,加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻颠倒振荡,充分混匀
8.12,000g,室温,离心15min
9.弃尽上清,加入70%的乙醇洗涤沉淀一次
10.超净工作台吹干沉淀,加入适量(15~20l)TE缓冲液或无菌水,溶解沉淀
11.取适量溶解液(3~5l),0.8或1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
实验三DNA琼脂糖凝胶电泳
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型,具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样,迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA),开环DNA,即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂,(opencircularDNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA,简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带,其中超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
(一)仪器:
1.琼脂糖凝胶电泳系统;
2.小型高速离心机;
3.高压灭菌锅;
4.紫外核酸检测仪
(二)材料质粒DNA
1.50×
TAE(50倍体积的TAE贮存液)1000ml
50×
TAE
1×
Tris
242g
40mMTris-冰醋酸
冰醋酸
57.1ml
1mMEDTA
0.5MEDTA
100ml
pH8.0
2.凝胶样品缓冲液(6×
):
0.25%溴酚蓝-40%蔗糖
3.琼脂糖
4.溴化乙锭母液(EB)10mg/ml
5.DNA分子量标准
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量(可参照下表)
不同浓度琼脂糖凝胶的DNA有效分离范围
琼脂糖凝胶浓度%
线性DNA的有效分离范围(kb)
0.3
5.0—60
0.6
1.0—20
0.7
0.8—10
0.9
0.5—7.0
1.2
0.4—6.0
1.5
0.2—3.0
2.0
0.1—2.0
实验用1.0%琼脂糖。
称取1.0g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100ml1×
TAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1.取干净的有机玻璃内槽,用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/ml(100ml凝胶液加入0.5μl)。
直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4.待胶凝固后,小心地拔出梳子,撕下透明胶带,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。
注意:
DNA样品孔应朝向负电极一端。
5.加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5cm。
(三)加样
1.DNA样品与样品缓冲液按1:
5比例混匀。
2.用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
(四)电泳
1.接通电泳槽与电泳仪的电源。
DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。
(50-100V)
2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
(五)染色(第二步没有加溴化乙锭的染色方法)
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200ml1×
TAE缓冲液中加两滴2mg/l的溴化乙锭储存液即可),在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。
溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境。
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。
DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,以防紫外线对眼睛的伤害作用)。
根据需要进行拍照,保存实验结果。
实验四、SDS法提取植物总DNA
植物DNA的提取过程中,首先必须破碎细胞壁释放出细胞内容物,然而许多操作在破壁的同时会造成DNA的断裂。
将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后,用研钵研成粉末后,再加入提取缓冲液,能够地防止DNA的断裂。
也可将植物组织胀水,然后研磨成细粉。
其次,提取DNA的缓冲液当,必须采用含有SDS和CTAB等去污剂,使细胞内源的核酸酶变性,防止同时释放出来DNA降解。
在提取过程中,注意防止剧烈振荡或枪头的快速抽吸,防止DNA的断裂。
[仪器、材料和试剂]
1.离心机
2.水浴锅(37℃,65℃)
3.研钵
4.50ml、2ml、1.5ml 离子管
(二)试剂
1.液氮
2.DNA提取缓冲液
50mMTris-HClpH7.6
100mMNaCl
50mMEDTA
0.5%SDS
10mMβ-巯基乙醇
3.氯仿/异戊醇(24:
1)
4.RNaseA
5.异丙醇
6.70%乙醇
7.TE缓冲液:
10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0
(三)材料
植物新鲜叶片组织
SDS法少量提取植物总DNA:
1.植物材料(根、茎、叶片等)0.4~0.6g,加液氮研成粉末后,加入DNA提取Buffer1.5~1.6ml,抽取15min,可以适当加热(60~65℃温育)。
2.分装于两个ependorf管中,每管各抽取液0.7~0.8ml,加入0.5(0.4ml)倍苯酚(Tris饱和酚),轻轻混匀,抽取5~10min,9,000g,离心10min
3.吸取上清,加入0.5(0.4ml)倍氯仿,轻轻混匀,抽取10~15min,12,000g,离心8min
4.收集上清,加入等体积异丙醇(总体积约为1.5ml),混匀,此时可见,白色絮状DNA沉淀,12,000g,室温下离心15min,吸去上清
5.70%乙醇洗涤沉淀一次
6.于37℃烘箱烘干沉淀
7.沉淀溶于适量TE,加入RNase使终浓度为50μg/ml,37℃消化30~60min
8.等体积苯酚-氯仿,氯仿各抽取一次
9.上清加入1/10倍体积的3MNaAc(pH5.2)和2~2.5倍体积预冷无水乙醇,混匀后,于-20℃放置30min,4℃,12,000g,离心15min,弃去上清
10.70%乙醇洗涤沉淀一次,干燥后溶于适量TE或水中
11.0.7~0.8%琼脂糖凝胶上检测植物总DNA;
剩余DNA样品保存于-20℃备用。
SDS法大量提取植物组织总DNA
1.植物材料(根、茎、叶片等)1~2g,加入DNA提取Buffer8ml,抽取15min,可以适当加热(60~65℃温育)。
2.加入0.5倍苯酚(Tris饱和酚),轻轻混匀,抽取5~10min,9,000g,离心10min
3.吸取上清,加入0.5倍氯仿,轻轻混匀,抽取10~15min,12,000g,离心8min
4.吸取上清,加入等体积异丙醇,混匀,此时可见,白色絮状DNA沉淀,用枪尖小心挑出DNA沉淀,放入ependorf管中;
12,000g,室温下离心5min,吸去上清
9.上清加入1/10倍体积的3MNaAc(pH5.2)和2~2.5倍体积预冷无水乙醇,混匀后,于-20℃放置30min,4℃,12,000g,离心15min,弃去上清
10.70%乙醇洗涤沉淀一次,干燥后溶于适量TE或水中
11.0.7~0.8%琼脂糖凝胶上检测植物总DNA;
[注意事项]
如果提取产物出现黄色现象,可能是植物组织含有褐色多酚类化合物,可以在提取缓冲液加入2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP,相对分子量10000),以有助于除去多酚类杂质。
实验四蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是蛋白分析中最经常使用的一种方法。
它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及巯基乙醇一起加热,使蛋白变性,多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原,肽链被打开。
打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷,电泳时在电场作用下,肽链在凝胶中向正极迁移。
不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同,在迁移过程中逐渐分开,其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
pET-SOD是将人Cu/Zn-SOD的基因克隆在pET30a(+)上的一种原核表达载体。
携带有pET-SOD的大肠杆菌在卡那霉素和IPTG诱导,可以表达人Cu/Zn-SOD蛋白,比不加IPTG同样的大肠杆菌在SDS-PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。
1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子
2.电泳仪
3.干式恒温培养器
4.微波炉
转化有pET-SOD的大肠杆菌。
1.30%丙烯酰胺溶液:
丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水至100ml,过滤,棕色瓶4℃保存。
2.分离胶缓冲液pH8.8(4×
1.5MTris-HCl,取18.15gTris,用1MHCl调pH至8.8,加水至100ml,4℃保存。
3.浓缩胶缓冲液pH6.8(4×
0.5MTris-HCl,:
取5.98gTris,用1MHCl调至pH6.8,加水至100ml,4℃保存。
4.电极缓冲液(pH8.3,5×
取94g甘氨酸,15.1gTris,加50ml10%SDS,加水至1L,4℃保存,使用时稀释5倍使用。
(1×
电极缓冲液为:
25mMTris-HCl、250mM甘氨酸、0.1%SDS)
5.10%SDS:
取10gSDS,加水至100ml,完全溶解后室温保存。
6.10%过硫酸铵溶液(AP):
临用前现配(-20℃可存放1个半月)
7.TEMED(四甲基乙二胺)
8.染色液(0.25%考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、7%乙酸):
考马斯亮蓝R-2502.5g、乙醇500ml、70ml冰乙酸,溶解后用蒸馏水定容至1000ml。
9.脱色液(30%乙醇、7%乙酸):
乙醇300ml,冰乙酸70ml,蒸馏水定容至1000ml。
10.2×
样品缓冲液
组份(20ml)
原液
加入量
100mMTris-HClpH6.8
0.5MTris-HClpH6.8
4ml
20%甘油
甘油
4%SDS
20%SDS
0.2%溴酚蓝
溴酚蓝
40mg
10mM-巯基乙醇
-巯基乙醇
0.2ml
H2O
8ml
[实验步骤]
1.蛋白质的诱导表达
将重组载体pET-SOD转入大肠杆菌BL21(DE3),挑单菌,接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜,取过夜培养物按1/50的比例扩大培养至OD600为0.5~0.6,吸取1ml培养物,收集菌体备用;
加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L,37℃继续摇菌4h,收集菌体,进行SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白表达情况。
2.蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳
(1)装配好灌胶用的玻璃板“三明治”,注意检查,勿使玻璃板“三明治”的夹缝是否漏水。
(2)配制浓度为12%的分离胶(凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择),不同分离胶配方参见如下表:
组分
分离胶
7.5%
10%
12%
15%
分离胶缓冲液
(pH8.8)(μl)
2500
1250
H2O(μl)
4900
2450
4100
2050
3300
1650
2400
1200
Acr/Bis(μl)
4000
2000
5000
10%SDS(μl)
100
50
30
10%AP(μl)
60
TEMED(μl)
12
8
总体积(ml)
10
5
10
混匀后加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封,目的是保持胶面平整,并防止胶与空气接触,影响胶的聚合),室温放置,等胶自然凝聚后(此时在胶面与水封之间可见清晰的界限),将水封倾去。
(4)配制4%的浓缩胶,不同浓缩胶配方参见如下表:
浓缩胶(pH8.8)
3%
4%
6%
浓缩胶缓冲液(μl)
625
3200
1600
3050
1500
2700
1350
500
250
650
375
1000
25
15
2.5
混匀后加入到"
三明治"
玻璃板的夹缝中,然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中,注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。
如果发现有较大的气泡,一定要想法去掉(可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等),否则会影响电泳结果。
待浓缩胶凝固后,小心拔出梳子。
如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲,用注射器的针头小心加以整理,使之齐整。
(5)细菌培养物SDS-PAGE样品的制作:
取细菌培养物0.3ml加到1.5ml小离心管中,12000r/m离心30s去上清。
在离心沉淀中加0.3ml蒸馏水,用枪头小心地吹打,使细菌充分悬浮,直到没有明显的小团块,然后加入等体积的2×
样品缓冲液,在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。
此时如用枪头吸取样品,会发现非常粘稠,呈鼻涕状,这是因为有样品中含有大量DNA的结果。
要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出,反复多次才能将DNA分子打断,使样品变得不再粘稠为止。
将样品14000r/m离心5min,使不溶物沉淀下来,小心吸取上清加样。
电
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