基因突变的蛋白质效应Word文档格式.docx
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1对象与方法
1.1对象2003年至2012年9月,我们对491700名新生儿采用MS/MS进行遗传代谢病筛查,发现60余例新生儿血C5-OH浓度高于正常切值0.6mmol/L,对其父母进行MS/MS分析,发现5例母亲(22~31岁)血C5-OH浓度明显增高(5.11~21.77)μmol/L,其中4例伴游离肉碱(freecarnitine,C0)降低(2.6~6.76)μmol/L。
5例母亲平素体健、孕期及分娩均无临床症状;
分娩的新生儿筛查时血C5-OH浓度增高(1.63~11.43)μmol/L,临床无症状(表1)。
1.2方法
1.2.1临床诊断及随访:
(1)采用尿气相色谱质谱仪(gaschromatographymassspectrometry,GC/MS)对血C5-OH增高相关的有机酸代谢病进行诊断与鉴别诊断;
(2)生物素酶活性测定以排除生物素酶缺乏;
(3)生化检测包括乳酸、血氨、肝肾功能、血气、酮体等;
(4)每3月~1年对5例新生儿随访,评估临床症状、生长及智能发育等,复查血MS/MS、尿GC/MS,了解临床转归。
1.2.2基因分析
1.2.2.1基因突变检测在知情同意的原则下,采集外周血抽提父母及新生儿、50个正常对照者基因组DNA;
参考文献[7]和PrimerPremier5软件设计引物,扩增MCCC1基因19个外显子和MCCC2基因17个外显子及两端内含子序列;
按常规方法和反应条件进行PCR扩增、测序,Chromas软件进行突变分析(参考MCCC1GenBank:
NM_020166.3;
MCCC2GenBank:
NM_022132.4)。
1.2.2.2基因新变异分析:
(1)正常对照者100个等位基因的相关片段测序分析以排除多态性可能。
(2)PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP):
采用BstXⅠ、AlwNⅠ两种限制性内切酶对c.203C>
C/p.L191P错义突变酶切分析。
(3)逆转录PCR测序:
提取患者RNA,经试剂盒TaKaRaPrimeScript®
RTMaster逆转录成cDNA进行测序分析,以验证剪切突变c.639+5G>
T。
(4)采用软件Clustal(1.81)对不同物种MCCC1和MCCC2氨基酸序列比对分析,以了解新型错义突变位点氨基酸的保守性。
(5)PolyPhen-2(http//genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT(http:
//sift.jcvi.org/)、UniProt(http:
//www.uniprot.org/)和PDB(http:
//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)软件分析新变异是否对蛋白质的结构和功能产生影响。
2结果
2.1临床诊断及随访
2.1.1母亲MCCD诊断5例母亲血MS/MS检测结果显示C5-OH浓度增高或伴C0降低,血异戊酰烯肉碱、丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱浓度均正常;
4例尿GC/MS结果显示3-MCG增高为2.18~272,3-HIVA增高为3.86~499(表1),无3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸、2-甲基-3-羟基丁酸及酮体等排出;
生物素酶活性正常;
根据上述排除其它C5-OH增高相关的有机酸代谢病,结合临床无症状,诊断为良性MCCD。
2.1.2子女诊断及随访5例新生儿筛查时血C5-OH浓度(1.63~11.43)μmol/L,出生2周召回时降至(1.01~9.37)μmol/L(下降36.14%),2例尿GC/MS分析显示3-HIVA或3-MCG略高,结合临床无症状、生化检查正常,诊断为母源性MCCD。
例1和例2分别于生后2.2岁及4月随访时,血C5-OH降至正常;
例4生后1.5月末次随访时,血C5-OH由11.43μmol/L降至5.81μmol/L(下降49.17%);
例2生后3周复查尿GC/MS时,尿3-HIVA降至正常;
例4尿3-MCG仍微量排出;
余2例未复查血尿。
所有新生儿末次随访年龄(1-38)月时仍无临床症状,生长及智能发育正常。
2.2基因分析
2.2.1基因突变4例母亲及子女接受了基因分析:
突变检出率为87.5%(7/8);
共检出4种MCCC1突变:
其中c.ins1680A突变频率最高,占25%(2/8),其他3种为c.203C>
C/p.L191P以及c.639+5G>
T,均未见报道。
共检出2种MCCC2突变:
c.1406G>
T/p.R469L(未报道)及c.592C>
T/p.Q198X(已报道)。
4例子女均携带来源于母亲的一个杂合突变。
(表1,图1)
表15例MCCD母亲及子女生化和基因突变结果
病例
血C5-OH浓度
血C0浓度
尿3-HIVA
尿3-MCG
母突变1
母突变2
子女突变
子女转归(C5-OH浓度)
母子/女
核苷酸改变突变效果
1
17.164.66
6.76ND
499N
60N
c.203C>
T*p.A68V*
c.ins1680A*插入突变
同突变1
2.2岁降至正常
2
5.111.63
NN
20.38.7
2.18N
c.572T>
C*p.L191P*
c.639+5G>
T*剪切突变
4月降至正常
3
5.622.34
6.55ND
3.86N
35N
c.592C>
Tp.Q198X
T*p.R469L*
未随访
4
21.7711.43
4.36N
12.59N
2721.33
1.5月下降49%
5
10.994.85
2.6N
NDN
ND
正常值
<
0.6μmol/L
10-60μmol/L
2.3
注:
*新突变;
N:
正常;
ND:
未检测
图14例母亲患者与子女的基因突变测序图谱1a:
例1母子MCCC1突变;
1b:
例2母子MCCC1突变;
1c:
剪切突变c.639+5G>
T突变型和野生型逆转录测序;
1d:
例3母子MCCC2突变;
1e:
例4母女MCCC1突变
2.2.2基因新变异分析
2.2.2.1正常对照者100个等位基因中未检出5种新变异,排除多态性可能。
2.2.2.2PCR-RFLP分析:
新变异c.203C>
T和c.572T>
C用BstXⅠ、AlwNⅠ两种内切酶进行酶切,结果提示BstXⅠ将对照者及父亲酶切产生136bp、117bp两个片段,c.203C>
T突变的等位基因由于不能被酶切而产生1个253bp片段,故携带此杂合突变的母子将酶切产生253bp、136bp和117bp三个片段(图2a);
AlwNⅠ将对照者酶切成137bp、128bp两个片段,c.572T>
C突变的等位基因不能被酶切而产生1个265bp片段,携带此杂合突变的母子经酶切产生265bp、137bp和128bp三个片段,未获得父亲DNA(图2b)。
图2PCR-RFLP酶切图2a:
BstXⅠ对例1c.203C>
T突变酶切;
2b:
AlwNⅠ对例2c.572T>
C突变酶切;
P:
母亲患者;
Z:
子女;
F:
父亲;
对照者
2.2.2.3剪接突变c.639+5G>
T经逆转录cDNA反向测序,结果显示外显子6出现148个碱基杂合缺失而引起剪接错误(图1c)。
2.2.2.4不同物种氨基酸序列比对:
2种MCCC1错义突变(c.203C>
T/p.A68V,c.572T>
C/p.L191P)及1种MCCC2错义突变c.1406G>
T/p.R469L经6个不同物种与人类基因相应位点氨基酸比对分析,MCCC1第68、191位和MCCC2第469位均为高度保守氨基酸(图3)。
图33种新错义突变在不同物种中的氨基酸序列比对
2.2.2.5PolyPhen-2、SIFT、UniProt和PDB分析3种新型错义突变经PolyPhen-2评分0.9~1,SIFT评分均为0,突变导致蛋白的侧链结构发生变化,可能改变蛋白构象而致病:
(1)c.203C>
T/p.A68V突变位于生物素羧化作用部位(蛋白质活性部位),突变导致68位丙氨酸变为缬氨酸,侧链结构改变并与73位缬氨酸主链形成新氢键,氨基酸残基较野生型增大(图4a);
(2)c.572T>
C/p.L191P突变位于ATP结合和生物素羧化作用部位(蛋白质活性部位)且位于肽链а-螺旋结构区,突变导致191位亮氨酸变为脯氨酸,侧链结构改变并与187位丝氨酸主链形成新氢键,氨基酸残基较野生型减小(图4b);
(3)c.1406G>
T/p.R469L突变位于羧基转移酶部位,突变导致469位精氨酸变成亮氨酸,侧链结构改变与468位丙氨酸主链间氢键消失,氨基酸残基较野生型减小且具有更强的疏水性,电荷显中性(野生型带正电)(图4c)。
图4蛋白质二级结构图红色:
突变位点氨基酸主链;
粉色:
侧链;
绿色虚线:
氢键;
粉色虚线:
突变产生的新氢键;
4a:
T/p.A68V野生型和突变型;
4b:
C/p.L191P野生型和突变型;
4c:
T/p.R469L野生型和突变型
3讨论
MCCD的临床表型差异较大,又分为有症状型,无症状型和母源型3种。
严重者在新生儿期表现为喂养困难、阵发性呕吐、腹泻,抽搐、嗜睡、昏迷、呼吸暂停、生长发育迟缓、肌张力异常等;
临床以无症状型多见[2-4];
母源型较少,即母亲为MCCD,因其增高的C5-OH通过母乳或胎盘传输给新生儿[8],导致新生儿筛查时血C5-OH增高,对父母检测后才发现母亲是MCCD患者。
有些母亲患者在禁食或高蛋白质饮食下、尤其在孕期可出现肌病、肝酶增高、脂肪肝和易疲劳等症状。
Gibson等[9]率先报道了4例MCCD母患共14次孕期及分娩史,其中仅1例曾出现上诉症状。
Koeberl等[10]报道4例MCCD母患,除1例曾在高蛋白饮食后出现呕吐外,其余均无症状。
母源性MCCD新生儿通常生后筛查时血C5-OH浓度不同程度增高,随访一段时间可恢复正常[9-11]。
本文在国内首次报道了5例母源性MCCD,母亲为良性MCCD,受影响的新生儿出生3天血C5-OH不同程度增高,随访后逐步下降或达正常(最长随访至3岁),均无症状,生长及智能发育正常,诊断为母源性MCCD(暂时性)。
因此,对新生儿筛查发现血C5-OH增高者,需常规对其母亲检测以诊断母源性MCCD。
MCCD与下列4种C5-OH增高疾病的鉴别主要依靠尿GC/MS。
(1)多种酰基辅酶A羧化酶缺乏症:
除尿3-HIVA及3-MCG增高外,3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸及酮体增高[12];
(2)3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症:
尿特异性3-羟-3-甲基戊二酸增高;
(3)3-甲基戊二酰辅酶A水解酶缺乏症:
3-甲基戊烯二酸、3-甲基戊二酸增高;
(4)-酮硫解酶缺乏症:
大量酮尿及2-甲基-3-羟基丁酸增高。
我们报告的MCCD母亲患者及其子女的血、尿质谱分析均排除了上述其他4种有机酸代谢病。
无临床症状的MCCD患者无需治疗。
对于有症状者可给予限制亮氨酸、蛋白质饮食,而甘氨酸或生物素治疗通常无效;
对于伴游离肉碱缺乏者需要补充左旋肉碱;
急性发作期患者应给予葡萄糖、纠酸、维持电解质平衡等治疗[13]。
MCCC1和MCCC2基因突变均可导致MCCD。
MCCC1定位3q25-27区,包含19个外显子,长度为2580bp,编码725个氨基酸多肽。
MCCC2定位5q12-q13.1区,包含17个外显子,长度为2304bp,编码563个氨基酸多肽。
MCCC1包含共价连接生物素的辅基及碳酸氢盐和ATP的结合位点,MCCC2则包含酰基辅酶A酶作用物的结合位点即主要结合甲基巴豆酰辅酶A[3]。
目前已报道MCCC1和MCCC2基因突变各60余种[14-16],c.1155A>
C(p.R385S)为较常见的热点突变。
2012年韩国首次报道c.838G>
T(p.D280Y)为其热点突变,日本于2007年也报道1例携带此突变[17]。
本研究发现3例母亲携带2个基因突变,1例仅找到1个杂合突变,可能因另一突变隐藏于非编码区无法经PCR直接测序检出或其他不确定因素造成;
新生儿均携带来自母亲的1个杂合突变,为杂合子。
MCCC1突变为MCCD患者较常见的突变。
已报道突变c.592C>
T/p.Q198X见于1例无症状新生儿筛查发现的MCCD患者,该突变位于羧基转移酶位点使198位谷氨酰胺变为终止密码子,影响了蛋白结构和功能[17]。
已发现的5种新变异均被证实可能对蛋白结构和功能产生影响:
T/p.A68V突变将产生新的氢键,氨基酸残基较野生型增大,可能无法匹配蛋白质的核心区域而影响蛋白的活性;
C/p.L191P突变也产生新的氢键,氨基酸残基较野生型减小,可能引起蛋白核心区域空缺,且突变后脯氨酸破坏α-螺旋结构,对蛋白质结构造成严重影响;
T/p.R469L突变引起氢键消失,氨基酸残基较野生型减小,疏水性增强,电性改变可能造成和其他分子相互作用消失;
c.ins1680A引起突变位点后第9个氨基酸提前出现TAA终止密码子造成蛋白结构改变;
T使外显子6杂合缺失引起剪切错误,造成蛋白结构改变。
因此,上述5种未报道的变异很可能是致病新突变,需进一步体外蛋白功能表达研究验证。
已有的研究提示MCCD表型和基因型间无明确的相关性,调控基因和环境因素等也可能影响表型。
例如,较常见的MCCC1突变p.R385S可导致严重的临床表型,但也可无症状,故难以通过基因型预测临床表型[3,11]。
因本研究病例较少,临床无症状,难以分析基因型和表型的关联性,尚需累积更多的病例进行分析。
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[14]ChoSY,ParkHD,Lee
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