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研究人员还发现,这一现象并没有遗传性,因为经过一轮感染后,在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。
这种现象被称为“宿主控制变异”,有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域
[4]。
直到上世纪60年代,人们才发现宿主控制变异的机制,其与噬菌体DNA的酶切有关,进而发现并分离出了限制性内切酶。
上世纪60年代初WernerArber观测发现,宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA之中,而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[5]。
这些发现最终催生了限制性修饰(R-M)体系的概念,通过该体系,来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用,切割外来病毒(非甲基化)DNA,同时保护宿主的DNA不受甲基化
[6]。
颇为有趣的是,大多数R-M体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的TypeI和TypeIII基团进行,该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能(参见限制性内切酶分类)。
然而在KentWilcox和HamiltonSmith发现第一种TypeII级限制性内切酶HindII之前,限制性内切酶显然还未得到充分利用[7]。
HindII能够识别特定的对称DNA序列,按照精确的方式切割识别序列内的位点。
此功能(大多数早期TypeII限制性内切酶均发现存在此功能)促使KathleenDanna和DanielNathans使用HindII研究猿猴空泡病毒40DNA
物理图谱[8],即所谓的限制性内切酶图谱。
凭借在限制性内切酶方面的开创性研究,DanielNathans、HamiltonSmith和WernerArber共同获得1978诺贝尔生理学或医学奖。
随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大,重组DNA技术应运而生。
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限制性内切酶命名规则
该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称,后面加上罗马数字,代表来自同一菌株的多个限制性内切酶
[9]。
例如,HindIII酶(或者按照早期命名规则命名为
HindIII)代表:
∙“H”代表Haemophilus
∙“in”代表influenzae
∙“d”代表血清型d
∙“III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶(例如,HindII和HindIII)。
限制性内切酶分类
根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求,限制性内切酶分为四类。
表1汇总了各类内切酶的区分特点
表1.限制性内切酶类别和特性。
内切酶类别
特点
TypeI
∙同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白
∙需要ATP
∙切割位点与识别位点间的间距不定
TypeII
∙特异性的识别序列
∙切割位点位于识别序列内或邻近识别序列
∙在切割位点生成5′磷酸基和3′羟基末端
∙需要Mg2+
TypeIII
∙由两个相反方向的识别序列组成
∙切割位点与其中一个识别序列的间距恒定
TypeIV
∙仅切割甲基化的DNA
∙切割位点大约距离识别位点30bp
由于自身特殊的特点,TypeII限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。
这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在限制性片段长度多态性(RFLP)分析,而后者也是法医学研究的基础。
连接酶可酶促连接DNA末端的5′磷酸基和3′羟基,从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5′磷酸基和3′羟基末端进行重排和连接—这也是重组DNA技术的基本原理。
由于在分子生物学研究方面很有用处,TypeII限制性内切酶成为了研究最多的酶类别,其成为了最大的内切酶类别。
目前经过鉴定的TypeII限制性内切酶超过3,500种,这些酶又被进一步细分成TypeIIP、IIA、IIB、IIC、IIS等子类别——其中的TypeIIP酶可识别回文(对称)靶标序列,是最流行的商业化限制性内切酶
[10]。
识别位点和切割特异性
另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。
∙同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。
例如,AgeI和BshT1可通过相同的图谱识别和切割5′-A↓CCGGT-3′。
但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。
∙异裂酶可以识别相同的核苷酸序列,但会在不同的位点切割DNA。
例如,异裂酶SmaI(5′-CCC↓GGG-3′)和XmaI(5′-C↓CCGGG-3′)均可识别5′-CCCGGG-3′但切割方式不同,因而产生不同类型的末端(此时,SmaI产生平端,而XmaI产生5′突出末端)。
识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。
参考文献
1.RobertsRJ,VinczeT,PosfaiJ,MacelisD(2015)REBASE—adatabaseforDNArestrictionandmodification:
enzymes,genesandgenomes.NucleicAcidsRes43:
D298–D299.
2.LuriaSE,HumanML(1952)Anonhereditary,host-inducedvariationofbacterialviruses.JBacteriol64:
557–569.
3.BertaniG,Weigl,JJ(1953)Hostcontrolledvariationinbacterialviruses.JBacteriol65:
112–121.
4.GrassoRJ,PaigenK(1968)Lossofhost-controlledrestrictionofλbacteriophageinEscherichiacolifollowingmethioninedeprivation.JVirol2:
1368–1373.
5.ArberW(1965)HostspecificityofDNAproducedbyEscherichiacoliV.Theroleofmethionineintheproductionofhostspecificity.JMolBiol11:
247–256.
6.ArberW(1965)Host-controlledmodificationofbacteriophage.AnnuRevMicrobiol19:
365–378.
7.KellyTJ,SmithHO(1970)ArestrictionenzymefromHemophilusinfluenzaeII.JMolBiol51:
393–409.
8.DannaK,NathansD(1971)Specificcleavageofsimianvirus40DNAbyrestrictionendonucleasefromHemophilusinfluenza.ProcNatlAcadSciUSA68:
2913–2917.
9.Smith,HO,NathansD(1973)Letter:
asuggestednomenclatureforbacterialhostmodificationandrestrictionsystemsandtheirenzymes.JMolBiol81:
419–423.
10.PingoudA,WilsonGG,WendeW(2014)TypeIIRestrictionEndonucleases–aHistoricalPerspectiveandMore.NucleicAcidsRes42:
7489–7527.
限制性内切酶关键注意事项
限制性内切酶一般反应条件
当进行限制性酶切反应时,为确保最佳的反应条件,务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。
在此过程中需要考虑的重要参数包括:
底物(DNA)和酶的量、反应体积以及孵育时间。
根据传统的定义,在最佳反应条件下,一个单位的限制性内切酶可以在1小时内,在50μL体系中完全酶切1μL定义底物(例如,质粒pUC19)。
尽管单位定义提供了一种测定方式,但还需注意,根据DNA底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型,针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。
实际上,酶供应商往往根据DNA样本的潜在质量、数量和性质波动,推荐比完全酶切所需量多5至20倍的酶(或1μL酶/反应体积)。
为确保限制性内切酶的有效活性,应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。
通常情况下,应将酶分成小等份,存储在–20⁰C条件下的无霜冰箱之中,从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。
DNA样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物,如核酸酶、盐、有机溶剂(例如,苯酚、氯仿或乙醇)以及洗涤剂。
为避免在–20°
C条件下结冰,限制性内切酶往往采用50%的甘油溶液形式提供。
但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。
最好是最后添加酶至终体积,添加之后就充分混匀。
“用手指轻弹反应管”轻柔混匀,然后短暂离心反应管,可帮助酶在反应混合物中充分扩散,并在反应管底部收集到反应溶液。
在孵育过程中,反应须达到所需的温度,并在整个孵育期间保持恒定。
如果使用5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时,这一点尤为重要。
须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发,否则可能造成孵育时间延长(例如,延长至>
1小时)和体积减少(例如,减少至
<
10
μL)。
除了一般的注意事项外,在您进行实验时还需注意限制性酶切的以下方面:
∙星号活性
∙不完全酶切
∙预料之外的切割图谱
∙甲基化
∙质量/使用寿命
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星号活性
星号或“松弛”活性是限制性内切酶的一种固有性质,即在非最优反应条件下,限制性内切酶可能会作用于与其天然识别位点存在细微差异的识别序列。
例如,如图1所示,EcoRI可以识别和切割位点5’-GAATTC-3’,但其星号活性可能导致序列在5’-TAATTC-3’和5’-CAATTC-3’处被切割。
同样,BamHI除了可切割其正常的识别序列5’-GGATCC-3’外,还可切割5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’和5’-GGNTCC-3’(其中N代表任意核苷酸)。
图1.EcoRI和BamHI两种常见限制性内切酶的潜在星号活性或松弛活性。
需特别指出,在最佳反应条件下,“星号”位点的切割率要远远低于正常的识别位点(大约相差105–106)。
因此,酶切期间出现星号活性的常见原因为限制性内切酶过量和/或孵育时间过长(过度酶切)。
此外,高浓度甘油(例如,>
5%)、低浓度盐、非最佳pH、存在有机溶剂,以及除Mg2+
之外的二价阳离子都可能造成底物DNA的非特异性切割。
使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液,可避免出现星号活性。
不完全酶切
不完全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。
当酶量过多或过少时,都可能发生不完全酶切。
DNA样本中存在污染物也可能导致不完全酶切。
缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不完全酶切的常见原因。
部分限制性内切酶需要辅因子才能实现完全活性。
例如,Esp3I(BsmBI)需要DTT,而Eco57I(AcuI)需要S-腺苷甲硫胺酸。
AarI和BveI(BspMI)等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割;
针对这一类酶,通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。
除了反应条件和酶性质外,DNA自身的性质也会影响限制性酶切(表1)。
甲基化的DNA可耐受部分限制性内切酶的切割(详见甲基化部分)。
酶的识别位点过于接近终端(线性底物DNA中)以及切割位点相邻(双酶切)都可能影响酶切割DNA的效率)。
此外,部分超螺旋DNA分子要比线性DNA分子更难切割,增加5-10倍的酶量可有助实现完全酶切。
表1.不完全酶切的常见原因。
反应条件
酶要求
底物DNA条件
∙酶量过少
∙底物过多
∙pH条件欠佳
∙温度欠佳
∙孵育时间过短
∙辅助因子
∙识别序列要求
∙首选位点
∙限制性位点邻近
∙结构
酶供应商在产品说明书中提供了使用建议,为实现完全酶切,必须严格遵守此类建议。
预料之外的切割图谱
即便遵守了制造商的使用说明,仍可能观察到预料之外的底物DNA切割结果。
为避免陷入此类困境,必须确保酶和DNA、反应所用的试剂均不含污染物(例如,其它限制性内切酶、DNA和核酸酶)。
出现预料之外切割的一个原因是,在增殖和扩增过程中,底物DNA引入了突变。
突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点,从而产生预料之外的酶切结果。
对DNA进行Sanger测序,是一种判断突变是否引起底物DNA出现预期外切割的有效方法。
有时候预期之外的酶切图谱是由检测过程而非酶切过程造成的。
部分限制性内切酶(例如,FokI,TauI)可能会与DNA紧密结合,导致电泳时出现明显的凝胶迁移。
使用含SDS的上样染料,加热使酶从切割的DNA上解离开来,均可避免出现这类凝胶迁移现象(图2)。
图2.限制性内切酶与DNA结合可能导致电泳时条带拖尾。
星号活性和不完全酶切也会导致凝胶电泳时出现预料外的条带。
因此,进行问题排除时必须区别这两种因素。
一种区分方法是根据孵育时间。
如果为星号活性,孵育时间越长,不理想条带通常越容易区分,而不完全酶切的不理想条带则会随着孵育时间延长而消失。
此外,不理想条带的大小也是一种区分方式。
部分源于星号活性的条带会比预期条带低,而不完全酶切的条带会高于最低预期条带(图3)。
图3.不完全酶切和星号活性的区分。
甲基化
DNA甲基化是真核和原核生物最常见的DNA修饰类型之一。
在细菌体内,DNA甲基化参与防御噬菌体感染的限制性修饰(R-M)防御系统(参见限制性内切酶基础知识),即保护宿主细菌自身的DNA不受内源性限制性酶切割。
甲基化通常发生在胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)碱基处,主要形成5-甲基胞嘧啶(m5C)、N4-甲基胞嘧啶(m4C)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)衍生物。
DNA甲基转移酶可将来自供体的甲基基团转移到受体甲基(例如,
A
和
C)上,催化甲基化反应。
在实验室细菌菌株之中最常见的DNA甲基转移酶类型包括:
∙Dam:
代表脱氧腺苷甲基转移酶,可以将序列5′-GATC-3′转化为5′-G(m6A)TC-3′
∙Dcm:
代表脱氧胞嘧啶甲基转移酶,可以将序列5′-CCWGG-3′转化为5′-C(m5C)WGG-3′(其中W代表A
或
T)
∙EcoKI:
代表大肠杆菌K12菌株内的TypeIR-M体系,可以修饰序列5′-AAC(N)6GTGC-3′内的腺苷
∙EcoBI:
代表大肠杆菌B菌株内的TypeIR-M体系,可以修饰序列5′-TGA(N)8TGCT-3′内的腺苷
在哺乳动物和植物系统中,CpG或CpNpG甲基化是生物进程中常见的DNA修饰,因而成为了表观遗传学的主要焦点。
限制性内切酶对于甲基化DNA识别位点的敏感度因酶的种类而异。
例如,如图4所示,GATC处的Dam甲基化完全阻断了MboI,但是激活了DpnI。
而5′-CCGG-3′的CpG甲基化阻断了HpaII活性,但却对MspI没有任何影响。
在部分情况下,限制性内切酶的活性会受甲基化部分抑制(例如,XhoI)。
图4.限制性内切酶对于底物DNA甲基化的敏感程度存在不同程度的差异。
在细菌内增殖质粒时,必须考虑到目标限制性内切酶甲基化的影响。
为防止在5′-GATC-3′和5′-CCWGG-3′位点发生甲基化,质粒转化应选择缺少Dam和Dcm甲基化酶的感受态细胞(dam–/dcm–)。
大多数大肠杆菌细胞不含CpG甲基化系统,因而从细菌分离的DNA不存在CpG甲基化问题。
如果基因组DNA提取自植物和哺乳动物,则可能在CpG位点发生甲基化,再通过部分甲基化敏感的酶影响限制性酶切。
质量/使用寿命
在选择限制性内切酶时,一个往往被忽略的因素是供应商的生产条例和质量流程。
为获得可靠的结果并最大限度避免各次实验运行间结果波动,研究人员应了解酶供应商生产这类产品时采取的质控和质量保证措施。
购买此类酶时应考虑的几个关键问题包括:
∙制造商的履历和资质如何?
他们在限制性内切酶研究和开发方面是否具有长期良好的声誉和成就?
─酶应该来自可靠的来源,才能获得一致的结果。
∙该类酶如何生产?
认证的生产地点是否符合各种国际质量标准,如ISO9001和无菌室环境?
─确保酶产品可靠,最大限度避免批次间差异非常重要。
∙制造商的产能如何?
针对大规模实验,他们能否提供大批量生产和定制包装?
─对于全基因组或高通量研究,稳定的大规模和定制生产很重要。
∙酶的性能如何?
接受过哪些测试?
他们的活性、纯度和应用是如何测定的?
这些测试是否足够灵敏,足以确保符合您的实验要求?
─提供质量控制文档是质量保证的一个重要措施。
∙供应商提供的知识广度和深度如何?
存在有关酶的疑问或产品相关的问题时,供应商是否积极提供了有益的支持?
─深入理解产品和实时提供支持,是供应商行使合作伙伴职能的关键。
总之,并不是所有的限制性内切酶都是一样的。
生产这类重要且关键的工具时所遵循的生产条例、质量控制和质量保证措施,是确保您的实验成功的关键,因此需要谨慎考虑。
资源
相关产品
∙限制性内切酶
∙DNA修饰酶
∙感受态细胞
限制性内切酶疑难解决指南
当使用电泳观察酶切结果时,您可能会观察到一些酶切问题,如:
∙不完全酶切或未酶切
∙意外的酶切图谱
∙DNA条带弥散
您可在此了解引起这些问题的可能原因以及我们对于解决这些问题的建议。
另请参见限制性内切酶关键注意事项
限制性酶切相关问题
不完全酶切或未酶切
可能原因
建议
酶失活
∙查看酶的过期日期
∙确保酶的储存温度为–20°
C。
低于该温度,酶可能会冻结,从而引起失活。
∙避免反复冻融(不超过三次)。
使用桌面冷冻盒存储和转移酶。
∙不要将酶储存于无霜冰箱或冷冻柜架上。
酶切方案欠佳
∙遵循生产商对于限制性内切酶和底物DNA类型的推荐实验方案。
∙确保所有添加剂或辅酶因子(如DTT、Mg2+、ATP、S—腺苷甲硫胺酸)添加至反应体系中。
一些限制性内切酶需要添加这些添加剂或辅酶因子才能表现出活性(例如,Esp3I需要DTT)。
∙使用推荐的和酶配套的反应缓冲液。
对于双酶切,请遵循生产厂家对于缓冲液兼容性以及其它反应条件的建议。
∙按照制造商指定的最优温度进行反应。
如果使用需要不同酶切温度的酶来进行双酶切,则需要先完成低温酶切,再进行第二次更高温度的酶切。
∙确保在孵育过程中,反应体积不会因蒸发而减少,从而导致盐浓度的升高,进而降低酶的活性。
对于嗜热的酶来说,请使用带有加热盖的热循环仪。
内切酶稀释不当
∙避免小体积(<
0.5µ
L)加样。
可通过配制更大体积的工作储存液,从而保证加入每个反应的酶量准确。
∙使用制造商推荐的稀释缓冲液配制工作储存液。
∙不要在水或者10X反应缓冲液中稀释限制性内切酶。
反应体系配制不当
∙最后一步向反应体系中加入限制性内切酶。
加入酶后,轻弹或混合反应管,以确保酶没有由于甘油密度的原因沉降在管底部。
反应混合液中存在过多的甘油
∙保持甘油在反应混合液中的浓度为<
5%。
加入反应体系的限制性内切酶体积应不超过总反应体积的1/10,尤其是在进行双酶切的时候。
∙确保反应体积不会因蒸发而减少,从而导致甘油浓度升高。
DNA浓度不佳
∙保持DNA在酶切混合液中的浓度在20–100ng/µ
L最优范围内。
DNA溶液污染
∙通过硅胶离心柱纯化或通过苯酚:
氯仿提取和乙醇沉淀去除残留的SDS、EDTA、蛋白质、盐或核酸酶。
用70%的冰点乙醇洗涤DNA沉淀,以除去EDTA和盐。
∙当酶切未纯化的PCR产物时,在酶切反应体系中,PCR混合液的体积应不超过最终反应体积的1/3(例如,在30μL总酶切反应体系中加入10μLPCR混合物)。
∙如果使用硅胶或树脂悬浮液纯
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