整理动物生物化学实验指导Word下载.docx

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仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。

9．实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。

实验一唾液淀粉酶活性的观察

原理

酶是指化学本质为大分子的生物催化剂。

在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即酶活性。

影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。

在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH即酶的最适PH。

例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适PH是6.8。

能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。

凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶因变性而丧失活性。

酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。

本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况，唾液中含有唾液淀粉酶，唾液淀粉酶的底物是淀粉。

淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。

而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示：

淀粉淀粉酶糊精淀粉酶麦芽糖+少量葡萄糖

加碘后：

（蓝色）（紫红色、暗褐色或红色等）（棕黄色、碘本身颜色）

试剂及器材：

1.试剂

（1）0.5%（w/v）淀粉溶液：

称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90mL沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100mL即成。

要求新鲜配制。

（2）稀碘溶液：

称取1.2gI2、2gKI，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200mL。

保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。

（3）不同pH溶液：

A液----0.2mol/LNa2HPO4溶液：

称取35.62gNa2HPO4.12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。

B液----0.1mol/L柠檬酸溶液：

称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。

1pH5.0缓冲液----取A液10.3ml、B液9.7mL混合而成。

2pH6.8缓冲液----取A液14.55ml、B液5.45mL混合而成。

3PH8.0缓冲液----取A液19.45ml、B液0.55mL混合而成。

配好缓冲液后应用酸度计验证。

（4）0.5%（w/v）蔗糖溶液：

称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100mL。

（5）斑氏试剂：

A液-----称取无水CuSO417.4g，将之溶于100mL预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml。

B液-----称取柠檬酸钠173g、Na2CO3100g，再加蒸馏水600mL，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850mL。

将A液与B液混合即得斑氏试剂。

（6）1%（w/v）NaCl溶液：

称取NaCl1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100mL。

（7）1%（w/v）CuSO4溶液：

称取无水CuSO41g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100Ml。

2.器材

（1）白瓷板（或比色板）

（2）恒温水浴锅

（3）电炉

操作

1、唾液淀粉酶应用液的制备

（1）每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。

（2）先用蒸馏水漱口，将口腔的食物残渣清除干净。

（3）口含约20mL蒸馏水，做咀嚼动作1-2分钟，以分泌较多的唾液。

然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中。

（4）取一块干净的白瓷板，按表1-1进行实验。

表1-1

穴号

试剂（滴）

1

2

3

4

5

6

7

蒸馏水

弃去

唾液

0.5%淀粉

碘液（滴）

结果（颜色）

以呈棕红色者浓度为准，稀释原唾液作应用液。

2、温度对酶活性的影响

（1）取3支试管，按表1-2进行实验。

表1-2

试管编号

0.5%淀粉（mL）

PH6.8缓冲液（mL）

0.5

稀释唾液（mL）

不同温度（℃）

置冰水浴中

置37℃水浴中

置沸水浴中

将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。

（1）在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加2滴碘液。

（2）每隔1分钟从第2支试管取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。

（3）待第2支试管中的反应液与比色板孔穴中的碘液混合后颜色不再变化时，取出试管，并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却，然后向各试管中滴加碘液1-3滴。

摇匀后观察并记录各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。

3、pH对酶活性的影响

（1）取3支试管，按表1-3编号后进行实验。

表1-3

管号

不同浓度pH缓冲液（mL）

PH5.0

--

PH6.8

PH8.0

稀释唾液（滴）

10

摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理。

（2）每隔1分钟从pH6.8的试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。

（3）待颜色呈棕色时，向各管中加稀碘液1-3滴。

观察各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，解释pH对酶活性的影响。

4、酶反应的特异性

（1）取2支试管，按表1-4编号后进行实验。

表1-4

试管号

0.5%蔗糖（mL）

（2）摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理10min。

（3）取出试管，分别加入斑氏试剂2mL，混匀。

（4）将各管置于沸水浴煮沸2-5min。

观察并解释结果。

5、激活剂与抑制剂对酶活性的影响

（1）取3支试管，按下表编号后进行实验。

1.5

PH6.8缓冲液（ml）

0.25

1%NaCl溶液（ml）

—

1%CuSO4

蒸馏水（ml）

稀释唾液

（2）每隔1分钟从第1支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。

（3）待颜色呈棕色时，取出3支试管，向各管中加稀碘液1-3滴。

观察各管颜色，并解释之。

实验二血清总蛋白的含量测定

本法所用试剂因能与双缩脲（H2NOC－NH-CONH2）产生紫红色反应而被称为双缩脲试剂。

实际上凡分子内含有两个氨基甲酰基（-CONH2）的化合物，不论是直接相连或是通过一个氮或碳原于间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。

蛋白质分子内含有许多肽键（—CONH—），因此可用双缩脲法作比色测定。

不含—CONH2，但含有-CSNH2、-C（NH）NH2或—CH2NH2等基团而具类似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性，所以本反应并非为蛋白质所特有。

但在体液中，除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。

各种血浆蛋白质，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血浆蛋白的比色测定中，双缩脲反应是较为理想的方法。

紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：

试剂和器材

一、试剂

双缩脲试剂：

称取硫酸铜（CuSO4·

5H2O，A．R．或C．P．）1．50g、酒石酸钾钠（NaKC4H406·

4H2O，A．R．或C．P．）6.0g，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移于1L容量瓶中，混和，再加入10％氢氧化钠溶液300ml，随加随摇匀。

最后用蒸馏水稀释至1L。

保存于塑料试剂瓶中或内壁涂一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。

如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。

二、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白溶液

10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。

作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。

2.待测蛋白质溶液

血清（稀释10倍）。

测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。

三、器材

试管，试管架，恒温水浴，721型分光光度计。

操作方法

1、取7只试管，按下表加入试剂：

酪蛋白标准液/ml

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-

蛋白浓度/（mg/ml）

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

未知样品液（ml）

蒸馏水/ml

0.0

双缩脲试剂/ml

2、摇匀，室温（15－25℃）下，放置30min。

3、以0管调零，在540nm波长处将各管溶液进行比色，读取各管光密度值（重复三次）。

4、取测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

5、6号管从标准曲线上查出待测样品蛋白质含量，即为样品液的蛋白质含量（mg/ml）。

注意事项

（1）本实验方法测定范围1－10mg蛋白质。

（2）须于显色后30min内比色测定。

30min后，可有雾状沉淀发生。

各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

实验三氨基酸的纸上层析与氨基酸移换作用

层析分离技术是一种物理的分离法。

利用待分析混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中。

所谓“相”是指一个系统中的某一均匀部分。

一般来说，其中一相是固定的，称为固定相，另一相是流动的液体或气体，称为流动相，两相互相接触。

待分析混合物的各组分以不同的速度移动，从而分离。

纸上层析是以滤纸作为支持物，滤纸总保持一些水分（约20～30％），使水称为层析中的“固定相”。

另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“移动相”。

把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借重力及滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。

层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。

分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。

反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。

溶质在纸上的移动速率可用比移（Rf）表示之。

各种氨基酸在一定的溶剂、一定的纸质及其他有关条件（湿度、PH等）固定情况下，各有其特有的，不变的Rf值。

氨基酸纸上层析常用的溶剂系统是：

水和酚，水和乙酸-丁醇，或水和二甲基吡啶等。

决定各氨基酸在两相溶剂系统中的分配系数的是氨基酸的化学结构。

例如，水是极性溶剂，而酚、丁醇或二甲基吡啶则是极性较低的溶剂。

因此，极性基团较多的氨基酸（如二羧基氨基酸）或极性基在整个分子中占比例较大的氨基酸和水的亲和力大，移动较慢，非极性基（如烃基、芳香基）所占比例较大的则和酚、丁醇等的亲和力大，移动也较快。

同一氨基酸在不同的溶剂系统中Rf值也不同，因此为了彻底分离某一混合氨基酸溶液，常用更换溶剂系统或双向层析的方法。

氨基酸一般为无色物质，所以通常在层析结束后，用茚三酮使之显色。

将色斑图谱及Rf值或标准的层析图谱及Rf值比较，可确定所分离氨基酸的种类。

如欲做定量测定，可把色斑剪下，溶于适当的溶液中于标准比色，也可直接在纸上用光密度计读数。

本实验结合转氨基作用来观察氨基酸的纸上层析。

转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。

在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α-酮酸上。

每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。

转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的谷丙转氨酶，能催化α-酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。

1、试剂

⑴0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液：

0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。

⑵0.1mol/L丙氨酸溶液：

称取丙氨酸0.819克先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/LNaOH仔细调节pH至7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。

⑶0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液：

称取α-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01mol/LpH7.4⑷0.1mol/L谷氨酸溶液：

称取谷氨酸0.735克先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/LNaOH仔细调节pH至7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。

⑸层析溶剂：

正丁醇:

水:

冰乙酸=4:

3:

⑹0.1%的茚三酮的无水丙酮溶液。

2、器材

⑴瓷研钵

⑵小试管二支

⑶刻度吸管

⑷层析滤纸

⑸毛细吸管

⑹培养皿，小表面皿

⑺电吹风

⑻剪刀、镊子

⑼圆规、直尺、铅笔（学生自备）

1、肝匀浆的制备：

称取新鲜的兔子肝脏1克，在研钵中用剪刀尽量剪碎，加入1ml预冷的0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液，将肝组织研磨制成匀浆，再加入8ml上述磷酸缓冲液，混匀。

2、保温：

取干燥试管两支，分别标明测定管与对照管，按下表操作：

试剂

测定管

对照管

肝匀浆（ml）

0.1mol/L丙氨酸（ml）

0.1mol/Lα-酮戊二酸（ml）

0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液（ml）

37℃预热2分钟

沸水浴5分钟

两管混匀后，置37℃水浴保温30～40分钟。

保温完毕，立即将测定管在火焰上加热煮沸2分钟终止反应。

冷却后，分别取两管的上层清液于白瓷比色盘小池中。

3、层析：

取直径12cm的圆形层析滤纸一张，用圆规作半径1cm的同心圆，通过圆心作两条垂线，用铅笔在交点处轻轻作一点样记号（见图）。

在1，3两点处分别点测定管和对照管上清液各5～6滴，在2，4两点处分别点0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸各1滴。

注意点样斑点不可太大（一般直径为0.2～0.5cm）。

吸取层析剂，加入直径3～5的表面皿中，再将表面皿置于一直径为10cm的培养皿正中。

在点样后的层析滤纸圆心处打一小孔，直径约为0.3cm。

另取同样滤纸一小片（约1×

2cm2），下一半用剪刀剪成须状，卷成圆筒如灯芯，插入小孔中固定（勿突出滤纸平面）。

将滤纸平放在培养皿中，灯芯浸入层析溶剂中，反盖上另一培养皿。

这时可见层析溶剂沿灯芯上升到滤纸上，再向四周扩散。

层析约30分钟后，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前缘处轻轻作一记号，用电吹风将滤纸吹干。

4、显色：

将上述滤纸用喷雾器喷上0.1%的茚三酮溶液，再用电吹风吹干，此时可见紫红色同心圆弧色斑出现。

计算各色斑的Rf值，将测定液和对照液中各色斑的Rf值与标准品的Rf值进行比较分析。

实验四血糖的测定 

葡萄糖在热醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成兰绿色西夫氏碱（Schiffbase），其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。

与同样处理的葡萄糖标准液比色（或根据其光密度查标准曲线）可求得待检血样品中葡萄糖的含量。

⑴邻甲苯胺试剂：

称取硫脲（A·

R）2.5g，溶于冰醋酸（A·

R）750ml中。

将此溶液转移入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4%硼酸溶液100ml，再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用两个月。

⑵葡萄糖贮存标准液（50mmol/L）：

将少量无水葡萄糖（A·

R或C·

P）置于硫酸干燥器内一夜。

精确称取此葡萄糖0.900g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。

置冰箱中可长期保存。

⑶葡萄糖应用标准液（1.25mmol/L）：

准确吸取葡萄糖贮存标准液2.5ml，置100ml容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液稀释100ml刻度。

⑷饱和苯甲酸溶液：

称取苯甲酸2.5g，加入蒸馏水1L中，煮沸使溶解。

冷后盛于试剂瓶中。

⑴试管及试管架

⑵吸量管

⑶水浴锅

⑷721型分光光度计

⑸方格坐标纸

标准曲线和回收试验

1、标准曲线：

配制一系列已知不同浓度的测定物标准溶液，按样品测定同样的方法处理显色，分别测得它们的光密度，再以光密度为纵坐标，浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，所得的曲线即标准曲线。

制作标准曲线的意义在于：

（1）作为校正曲线，从浓度—光密度的直线特性，可判断某方法中化学反应产生的颜色物质是否符合或遵守朗伯特—比尔定律。

（2）可判断在测定操作过程中，操作、仪器等误差的大小，从而确定方法的可靠性。

（3）作为工作曲线，在大量进行样品中测定物含量分析时，通常用作计算的基础，即从曲线上可直接找到测定液的光密度所相当的浓度。

2、回收试验：

比色法中测定液除含待测成分外，还含有许多非测定成分而与标准液不一致，它们是否影响显色反应引起误差，常借回收试验来检查。

在待测样品中加入已知浓度的标准物质，在按样品测定的条件和方法进行测定，然后计算测出标准物质量占加入标准物质量的百分率，这种试验即回收试验，算出的百分率即回收率。

回收率愈接近100%愈好，一般认为达到100±

5%即较为理想。

回收率的好坏在一定程度上说明测定结果的准确度，也可反映干扰物质存在与否，影响程度如何，以及这种影响与浓度有无关系；

此外，还可以检查操作误差和仪器误差。

取洁净干燥试管8支，编号，按下表操作：

试剂

（ml）

空白管

（1）

标准管

（2）（3）（4）（5）（6）

测定管

（7）

回收管（8）

血浆（或血清）

—————

0.05

葡萄糖标准液

（1.25mmol/L）

0.10.20.30.40.5

0.50.40.30.20.1

0.55

0.35

邻甲苯胺试剂

5.0

5.05.05.05.05.0

混匀后置沸水浴中加热15分钟。

取出，用流水或冷水浴冷却。

用630nm波长进行比色，以空白管校正光密度到零点，读取各管光密度读数。

计算及作图

1、选择与测定管接近的标准管的光密度值，列出计算公式，计算出血浆（或血清）中葡萄糖的含量（mmol/L）。

2、将以上各标准管的光密度值为纵坐标，相应的各标准管的葡萄糖的浓度（依次相当于2.5mmol/L，5.0mmol/L，7.5mmol/L，10.0mmol/L，12.5mmol/L）为横坐标，在座标纸上作图，绘制成标准曲线。

3、从标准曲线中查出血浆或血清的葡萄糖含量，并与计算结果作比较。

4、回收率的计算：

⑴选择与回收管接近的标准管的光密度值，列出计算公式，计算出回收管的葡萄糖含量（mmol/L）。

⑵计算回收量：

回收量（mmol/L）=回收管葡萄糖含量（mmol/L）—测定管葡萄糖含量（mmol/L）

⑶计算回收率：

注：

加入量在本次实验中为5.0mmol/L。

正常值

3.89mmol/L～5.89mmol/L

临床意义

血糖超过正常最高值，称为高血糖症，常由糖尿病、甲状腺机能亢进、脑垂体前叶机能亢进、肾上腺皮质和髓质机能亢进等疾病引起。

血糖低于正常最低值，称为低血糖症，多见于胰岛素分泌过多、肾上腺机能减退、脑垂体机能减退、甲状腺机能减退等。

实验五组织DNA与RNA的分离和提纯

一、原理

脱氧核糖核蛋白（DNP）在0.14mol/LNaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）却较易溶解，故用0.14mol/LNaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即可得到DNA。

RNA的分离提纯目前多用苯酚法。

组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠存在下，RNA与蛋白质分离。

酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。

二、操作

（一）DNA的提纯

1.取小鼠剪断颈动脉，放血处死。

立即开腹，取其脾脏及两肾脏（约0.3g），浸于预冷至0℃的0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA中，洗去其血液，剥去周围的脂肪及结缔组织，用滤纸吸干水分。

2.将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液7ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。

3.离心，2500r/min，15min。

吸弃上层液体，向沉淀中再加0.14mol/LNaCl-0.01mol/L　EDTA液混匀，离心洗涤之（如欲获取掺杂RNA较少的纯DNA时，此步离心洗涤应重复