糖尿病及血管新生因子对动脉粥样硬化斑块不稳定性的影响及作用机制Word文档下载推荐.docx
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另有研究指出,在糖尿病小鼠模型中,活化的AMPK有抑制AS发展的作用。
活化蛋白2α(activatorproteinAP-2α)是一种细胞核内转录因子,具有一段通用识别序列:
GCCNNNNGGC,与内皮细胞内金属蛋白酶代谢调节相关。
在我们已有的研究结果中,AMPK可以通过磷酸化AP-2α的219丝氨酸位点,调节腹主动脉瘤中细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)成分的代谢失调。
在我们的另一项最近发表的研究中也发现,激活AP-2α可以增加小鼠AS斑块的稳定性。
斑块纤维帽中ECM的主要构成部分有纤维状蛋白质(如:
胶原,弹性蛋白)和粘附蛋白(如:
层黏连蛋白,纤连蛋白),他们之间相互作用形成的骨架结构维持了斑块外纤维帽的稳定性,其中胶原是最主要的一种具有代谢活性的ECM成分,在AS斑块稳定性中发挥重要作用。
4羟基-脯氨酸羟化酶(Prolyl-4-hydroxylase,P4H)是胶原合成过程中促进前骨胶原多肽折叠而形成稳定的三螺旋结构的关键酶。
P4H由两个α亚基和两个β亚基构成,其中α亚基负责酶的催化活性作用,是胶原合成与分泌过程中的重要限速酶。
体外研究显示,抑制P4Hα1可以减少平滑肌细胞合成和分泌胶原,进而影响平滑肌细胞迁移;
而过表达P4Hα1基因则可以促进胶原生成。
综上所述,糖尿病加速AS的分子机制尚未明确,既往关于合并糖尿病的AS易损斑块的研究并未关注高糖直接影响斑块纤维帽内胶原代谢而导致斑块易损;
另外,斑块内血管新生因子与炎症反应之间存在着复杂的相互促进的关系,但其具体机制尚无定论;
基于上述原因,本文将分别在论文I中论述糖尿病对AS斑块易损的影响及具体机制,论文Ⅱ中将对斑块内血管新生因子与炎症反应之间的关系进行深入探讨。
2目的
(1)在体内实验中明确AMPK及其激活剂二甲双胍对AS斑块稳定性的影响。
(2)体外实验中探讨高糖环境对平滑肌细胞内胶原合成通路的影响。
(3)体内体外实验同时验证AMPK如何参与调节斑块内胶原代谢。
3方法3.1动物模型构建第一部分动物实验:
100只8周龄雄性ApoE-/-小鼠给予高脂喂养2周后,随机分为四组:
1)对照组(Control组,n=25):
给予一定体积正常饮用水;
2)二甲双胍组(Metformin组,n=25):
将二甲双胍粉末溶解于正常饮用水中配制二甲双胍溶液,给予浓度为50mg/kg/day的二甲双胍溶液,体积同对照组;
3)糖尿病组(DM组,n=25):
给予同正常对照组等量体积正常饮用水4)糖尿病+二甲双胍组(DM+Metforrmin组,n=25):
将二甲双胍粉末溶解于正常饮用水中配制二甲双胍溶液,给予浓度为50mg/kg/day的二甲双胍溶液,体积同对照组。
第二部分动物实验:
100只8周龄雄性ApoE-/-小鼠同样给予高脂喂养2周后,随机分为4组:
1)正常血糖+病毒空载体组(Con-Ad-EGFP,n=25):
尾静脉注射只携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)的腺病毒(3.0X109ifupermouse);
2)正常血糖+AMPKα腺病毒组(Con-Ad-AMPKα,n=25):
给予尾静脉注射携带AMPKα的腺病毒(3.0X109ifupermouse);
3)糖尿病+病毒空载体组(DM-Ad-EGFP,n=25):
尾静脉注射只携带GFP的腺病毒(3.0X109ifupermouse);
4)糖尿病+AMPKα腺病毒组(DM-Ad-AMPKα,n=25):
给予尾静脉注射携带AMPKα的腺病毒(3.0X109ifupermouse)。
3.2组织病理学检测留取甲醛固定后的右侧颈动脉组织制备冰冻切片,对动脉斑块组织进行H&
E染色、油红O染色以及天狼猩红染色。
同时,采用免疫组织化学染色的方法检测颈动脉斑块组织内平滑肌细胞,巨噬细胞以及Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的含量,计算斑块易损指数。
3.3细胞培养及腺病毒转染人血管平滑肌细胞(humanvascularsmoothmusclecells,VSMCs),给予2%胎牛血清(FBS)+青霉素+链霉素,于5%CO2,37℃孵育箱培养,所有实验均使用4-8代细胞。
细胞密度达到80%时给予空白病毒载体及AMPKα过表达的腺病毒转染,过夜培养后,换新鲜培养基冲洗后并继续培养24小时,转染效率达80%。
3.4免疫印迹(WesternBlot)检测经过提取细胞、组织蛋白,进行凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。
3.5实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)通过特殊miRNA提取试剂盒分别提取细胞及组织miRNA,利用逆转录和RT-PCR的方法对VSMC细胞水平,及颈动脉斑块组织水平的内的内参基因U6,及目的基因miR124进行检测。
3.6质粒转染及报告基因实验构建质粒(P4Hα1-3’UTR,MT-P4Hα1-3’UTR,miR-124promoter,△miR-124promoter),同外源性miR-124或AP-2α转染进入HEK293T细胞,培养48小时后,检测荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。
3.7染色质免疫沉淀(ChIP)分析用超声碎波将培养的细胞打碎以获取染色质片段,将抗目的蛋白的抗体与染色质片段结合后,用含有目的片段的引物进行PCR扩增,观察目的蛋白与启动子活性片段的结合能力。
3.8统计学分析运用SPSS统计分析软件进行所有数据的分析,非配对t检验用于比较两组间的差异。
Two-wayANOVA用于不同变量组间差异分析,P值小于0.05时具有统计学意义。
4实验结果4.1高糖增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定性斑块易损指数计算公式=(油红O+巨噬细胞)/(VSMC+胶原含量)。
根据统计分析显示,小鼠体内高糖状态会显著增加斑块内巨噬细胞浸润和油红O染色面积,同时减少纤维帽上平滑肌细胞和胶原的表达,易损指数显著升高,提示糖尿病促进斑块易损。
4.2二甲双胍增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性为研究二甲双胍的心血管保护作用,给予小鼠12周二甲双胍喂养,结果显示二甲双胍组糖尿病小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞浸润、脂质沉积显著降低,纤维帽平滑肌细胞及胶原成分显著增加,提示二甲双胍具有维持斑块稳定的作用。
4.3二甲双胍激活糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块中AMPKα活性二甲双胍是经典的AMPK激活剂,因此,我们验证了在糖尿病小鼠颈动脉斑块中,二甲双胍通过磷酸化Thr172从而激活AMPKα。
提示在糖尿病小鼠体内,二甲双胍通过激活AMPK发挥稳定斑块的作用。
4.4AMPKα过表达增加糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性为了明确AMPK在糖尿病促AS斑块易损中发挥的作用,我们构建了AMPKα2过表达病毒,通过尾静脉注射的方式将病毒输送至小鼠体内,结果显示过表达AMPKα可以显著降低颈动脉斑块内巨噬细胞浸润及脂质沉积,同时增加纤维帽层VSMC和胶原的含量,证明了高糖通过抑制AMPKα活性而导致了斑块易损的发生。
4.5平滑肌细胞内高糖抑制胶原合成给予平滑肌细胞高糖(HG,30mM,D-glucose)刺激,进行时间梯度实验,结果显示pAMPKα,Ⅰ/Ⅲ型胶原表达均逐渐降低;
当我们在VSMC细胞中转染AMPKα过表达腺病毒,胶原表达显著增加,提示高糖通过抑制AMPKα而发挥减少胶原含量的作用。
4.6AMPKα过表达增加高糖处理的VSMCs中P4Hα1表达HG处理的VSMC中,P4Hα1表达随时间梯度呈降低趋势,过表达AMPKα后,P4Hα1表达升高,提示HG通过AMPKα抑制P4Hα1表达。
为了进一步验证P4Hα1对下游胶原合成的影响,在VSMC中过表达P4Hα1基因,可以增加HG刺激组Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达,提示HG通过抑制P4Hα1抑制胶原合成。
4.7miR-124通过结合P4Hα1的3’-UTR区域抑制其表达小RNA(miRNA)是一种约20个核苷酸组成的,单链RNA分子,他们通过结合于目的基因的3’非翻译区域(3’-UTR)从而抑制目的基因的表达。
通过运用预测软件,我们发现miR124可以特异性结合于P4Hα1的3’-UTR区降低其表达,我们构建质粒载体,通过双荧光素酶报告基因方法验证了二者间的特异性结合。
4.8AMPKα过表达可逆转VSMC中HG诱导的miR-124表达上调HG处理的VSMC,miR-124表达明显增加,为了验证AMPK参与这一调控过程,我们在VSMC中转染AMPKα腺病毒,结果显示,在HG环境中,过表达AMPKα可以抑制miR-124的表达,由此提示,AMPK参与了HG调控miR-124的过程。
4.9转录因子AP-2α负向调控miR-124表达为了验证miR-124的上游调控子,我们利用生物信息学网站预测了miR-124启动子序列在-842到-364bp区间,为了验证这一预测,我们合成了包含这一序列的质粒转染HEK293T细胞,Real-timePCR结果提示相对于空载体组,转染这一启动子序列的质粒会显著增加miR-124的表达,从而确认了预测的准确性。
同时,为了证明AP-2α可能具有调控miR-124表达的作用,我们分别在体内、外实验中,过表达或降低表达AP-2α,Real-timePCR结果提示AP-2α具有负相调控miR-124表达的作用。
我们利用染色质免疫沉淀(ChIP)分析的方法进一步验证了AP-2α特异性结合于miR-124的启动子序列从而发挥其负向调控作用。
4.10AMPKα过表达增加糖尿病小鼠AS斑块内胶原含量为了在体内证明AMPKα是通过调控下游AP-2α介导的miR-124/P4Hα1信号通路来发挥其对AS斑块胶原代谢的影响,我们检测了斑块组织内P4Hα1、Ⅰ/Ⅲ型胶原的蛋白水平表达,结果显示糖尿病显著增加斑块内miR-124的表达,却减少P4Hα1、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达,但在过表达AMPKα的斑块中却未观察到这一现象。
综合上述结果,我们得出结论:
AMPKα依赖型的AP-2α/miR-124/P4Hα1信号通路对AS斑块中的胶原代谢发挥着重要作用。
4.11二甲双胍在ApoE-/-小鼠体内激活AMPKα/AP-2α/miR-124/P4Hα1通路最后,我们在糖尿病小鼠体内验证了二甲双胍与AMPKα激活及一系列下游通路之间的关联性。
在此部分动物实验中,与血糖正常组小鼠相比,糖尿病组小鼠体内pAP-2α,P4Hα1蛋白表达水平均下调,Ⅰ/Ⅲ型胶原含量下降,miR-124表达增加,而二甲双胍组则可以明显逆转这一现象。
因此我们认为在糖尿病小鼠体内,二甲双胍具有激活AMPKα/AP-2α/miR-124/P4Hα1信号通路的作用。
5结论
(1)糖尿病通过减少小鼠颈动脉斑块纤维帽层胶原含量导致斑块易损。
(2)高糖通过抑制AMPKα/AP-2α/miR-124/P4Hα1信号通路,抑制平滑肌细胞内胶原合成。
(3)转录因子AP-2α结合于miR-124的启动子区域从而负向调控其表达。
(4)二甲双胍可以通过激活AMPKα/AP-2α/miR-124/P4Hα1发挥稳定AS斑块的作用。
1研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种主要累及大、中型动脉血管管壁的慢性炎症反应性疾病。
其主要病理特征是进行性的脂质沉积、纤维组织增生和炎性细胞的浸润。
炎症反应贯穿了整个AS发生与发展进程,多种炎症细胞及细胞因子参与这一过程,其中单核细胞在粘附分子和化学趋化因子的作用下粘附、迁移、浸润至内皮细胞下,分化成为巨噬细胞,斑块内的巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白胆固醇(OxidativeLDL-C,ox-LDL-C)后形成泡沫细胞,进而形成斑块的脂质核心。
在肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensinsystem,RAS)过度激活、氧化应激加剧等外界刺激因素的作用下,斑块内炎症转变为活动性炎症,容易诱发斑块破裂、糜烂和血栓形成,导致急性心血管事件的发生。
在最新的全球尸检研究汇总结果中,大多数致死性冠状动脉血栓与斑块破裂有着密切关联,同时斑块破裂也是引起心肌梗死(Myocardialinfarction,MI)的最主要原因。
斑块破裂最易发生的区域是纤维帽最薄弱且伴有大量泡沫细胞(巨噬细胞)浸润的区域。
巨噬细胞在作为AS斑块损伤中所占比例最多的免疫细胞,参与了AS发展的全部进程。
巨噬细胞分泌在趋化因子MCP-1的同时也会分泌其他血管生成因子,如纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF),又称为FGF2或者FGF-β,是一种已经有大量研究基础的纤维细胞生长因子家族成员,研究显示其在促进AS斑块内微血管的生成,斑块内出血,及血栓形成有重要作用。
FGF2是由多个蛋白异构体构成的,由于FGF2基因的蛋白翻译水平的差异从而产生了小分子量(Lowmolecularweight,LMW)和大分子量(Highmolecularweight,HMW)两种不同的异构体。
有关FGF2异构体-特异性的若干研究显示:
在体外和体内实验中,LMW异构体和HMW异构体的蛋白水平表达具有组织特异性,二者具有独立的生物学活性。
LMW异构体,是一个18kDa的FGF2异构体,是由一段保守的KozakAUG起始的密码子翻译而来的,是一种仅包含了155个氨基酸的小分子蛋白,主要分布于细胞质和细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)中,而HMW异构体则被发现仅位于细胞核中。
但是由于缺乏HMW异构体特异性抗体,以及重组蛋白的构建困难,现阶段所有用于临床试验和基础研究的重组FGF2均为LMWFGF2。
尽管在基础研究中,大量证据支持了LMWFGF2的心血管保护作用,但应用于临床实践中效果大相径庭,推测可能的原因是在机体发生急性缺血事件时,FGF2的促血管新生作用无法立即发挥作用,但其在斑块破裂形成血栓时,与急性炎症反应的相互作用反而加重疾病进程,所以关注FGF2与炎症反应之间的相互作用及具体机制至关重要。
综上所述,在AS发生与发展过程中,FGF2可以通过促进血管新生发挥促斑块易损的作用,同时也参与调节斑块内血管新生与炎症反应之间的相互作用,且由于FGF2在糖尿病动物体内的高表达,我们推测FGF2在糖尿病AS病理过程中也可能发挥重要作用,所以在本研究的此部分内容中,我们成功构建了LWMFGF2基因与载脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)基因双敲小鼠模型,从基因水平上阐明LWMFGF2在AS发生与发展过程中的作用及具体机制。
2目的
(1)通过构建ApoE-/-Fgf2lmw-/-基因双敲(DKO)小鼠AS疾病模型,明确LWMFGF2在斑块发展的不同时期对斑块负荷及稳定性的影响;
(2)在体内研究中,探讨基因敲除LWMFGF2异构体促进斑块稳定的作用机制。
3方法3.1基因敲除小鼠模型构建120只8周龄雄性ApoE-/-小鼠与120只8周龄雄性ApoE-/-Fgf2lmw-/-小鼠,体重均在20-22g范围内,给与全程高脂饮食喂养。
18-kDa-FGF2基因敲除小鼠(FGF2lmw-)于美国Jackson实验室购入。
双基因敲除小鼠品种是通过杂交ApoE-/-小鼠与Fgf2lmw-/-小鼠获得,回交不少于20代后用于本实验。
为探讨18-kDa-FGF2敲除对AS各个进程的影响,随机将实验小鼠分为早期斑块组(高脂喂养8周),进展期斑块组(高脂喂养12周),晚期斑块组(高脂喂养16周)。
根据不同喂养周期,实验结束后,全部小鼠被处以安乐死。
每组各40只小鼠。
3.2体重及血脂指标的检测实验结束时,对所有小鼠进行经左心室穿刺采血留取血清备用。
用酶学法检测血清中总胆固醇(totalcholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoprotein-cholesterol,LDL-C)以及高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoprotein-cholesterol,HDL-C)的水平。
3.3组织病理学检测留取甲醛固定后的主动脉根部组织制备冰冻切片,对动脉斑块组织进行H&
E染色及油红O染色。
同时,采用免疫组织化学染色的方法检测主动脉根部斑块组织内巨噬细胞及各项炎症反应因子的含量。
3.4免疫印迹(WesternBlot)检测经过提取动物组织蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察18-kDa-FGF2蛋白的表达。
3.5统计学分析运用SPSS统计分析软件进行所有数据的分析,非配对t检验用于比较两组间的差异。
P值应小于0.05时具有统计学意义。
4实验结果4.1ApoE-/-Fgf2lmw-/-双敲基因小鼠模型的基因型鉴定我们用琼脂糖凝胶电泳的方法对小鼠进行基因型鉴定,基因鉴定结果分析显示双敲小鼠在265bp处及476bp处均有条带,WesternBlot检测蛋白水平证实了双敲小鼠血管组织中18-kDa-FGF2蛋白无表达,提示DKO小鼠成功构建。
4.2动物一般情况血清学检测显示ApoE-/-小鼠与双敲小鼠间体重及血脂水平没有显著差别。
4.3敲除18-kDa-FGF2影响主动脉环出芽数量将DKO组小鼠及ApoE-/-对照组小鼠胸主动脉环固定于Ⅰ型鼠尾胶原中,连续培养数天后观察出芽情况:
培养至第八天,DKO组出芽数量显著少于对照组。
提示敲除LWMFGF2可以显著降低血管新生的能力。
4.4基因敲除18-kDa-FGF2减轻AS斑块负荷主动脉大体油红O染色与主动脉根部染色结果均提示,敲除低分子量FGF2,在AS发生发展的各个时期均会减轻ApoE-/-小鼠斑块损伤面积。
4.5敲除18-kDa-FGF2减轻斑块内巨噬细胞浸润在主动脉根部斑块染色结果中,相比于ApoE-/-对照小鼠组,敲除18-kDa-FGF2的小鼠,在AS进展发展早期,中期,晚期,均可以减少斑块内巨噬细胞的表达。
4.6敲除18-kDa-FGF2影响斑块内趋化因子及黏附分子的表达应用免疫组织化学的检测手段显示,在AS发生发展的早、中、晚期(8周,12周,16周),相比于ApoE--小鼠,敲除18-kDa-FGF2主动脉根部斑块中,MCP-1及VCAM-1的表达均显著降低。
4.7敲除18-kDa-FGF2减轻AS斑块损伤中氧化应激反应同样地,在敲除了低分子量FGF2基因的ApoE-/-小鼠中,NADPH氧化酶的两个亚型:
p47phox和Nox4的表达相比于普通ApoE-/-对照小鼠均显著下降。
5结论
(1)通过构建ApoE-/-Fgf2lmw-/-双敲基因小鼠模型进一步验证了18-kDa-FGF2在AS疾病中的作用。
(2)敲除18-kDa-FGF2在AS发生发展的各个时期均有显著降低巨噬细胞浸润,促炎因子分泌,及氧化应激反应的作用。
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