细胞信号时空动态的前沿研究和关键技术Word文件下载.docx

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从而造就一批在细胞信号时空动态研究领域有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，建设一支结构合理、具备攻坚能力的国际水平研究队伍；

6．主办1～2次细胞信号动态国际学术会议，强化我国在该领域的国际学术地位；

7. 

研究成果主要以研究论文和独立开发的技术成果（专利）形式公布，五年争取发表SCI论文100篇，其中相关领域主流学术期刊不少于40%，力争在Cell、Nature或Science上发表论文，并申报专利10项。

三、研究方案

1.总体学术思路：

首先，我们基于以往突破性进展的基础，继续深入研究细胞钙信号和超氧炫的时空动态及其调控机制。

这些调控机制必然涉及相关信号通路一些关键蛋白，我们将通过对这些蛋白分子动态和相互作用的研究深入地阐明它们与钙信号和ROS信号系统的相互调控。

这三个方面在思路上以分析为主。

在上述分析的基础上，我们将通过两种方式进行整合研究。

一方面是针对参与钙信号和ROS相互作用的关键蛋白，利用基因敲除、定点突变等遗传干预手段“牵一发而动全身”，通过单因素变化导致的多因素变化来推断多信号体系的调控关系；

另一方面在大量时空动态实验数据的基础上构建数学模型，从控制原理和优化理论的角度研究系统的性质，揭示微观随机信号形成系统稳健性的原理。

细胞信号时空动态研究很大程度上依赖研究技术的进步。

我们的前沿探索将对显微成像技术、分子探针、多维图像算法等提出较高的需求，因此将发挥项目组成员的多学科优势实现新模态、高分辨、高通量成像技术的自主创新。

2.技术路线及可行性：

本项目将采取多学科相互交叉、渗透和有机结合的途径，重点围绕钙信号和ROS信号时空动态关系，研究关键信号蛋白如何相互作用实现稳态这一关键科学问题，结合分子探针、显微成像关键技术的完善与发展，系统地开展跨学科的基础研究。

细胞信号成像将采用激光共聚焦显微成像系统。

在需要较高时间分辨率的研究中采用高速共聚焦系统，数据采集速率可达100～1000帧/秒，细胞的三维扫描可在1秒中完成。

我们将自行研制STED系统用于空间高分辨成像，研制CARS和SRS系统用于非荧光探针成像。

为了高效率处理大量多维图像数据，我们将发展经验性数据驱动（empirical,data-driven）分析方法，利用主成分分析进行数据降维，把降维后的数据投射到一个Langevin方程上，衍生出一系列小规模的动力系统。

用独立成分分析以及去卷积计算细胞信号的时空序列。

在关键信号蛋白的研究中，我们将利用在分子生物学、细胞生物学以及生物化学方面的良好工作基础，根据项目对信号蛋白的观测需求，采用不同技术途径实现信号蛋白及其相互作用的可视化。

我们将在“大肠杆菌-哺乳细胞”穿梭体系和分子进化平台的基础之上，构建新颖的高通量变异体筛选库，实现非天然氨基酸分子标记。

我们还将设计具有特殊光学性质的荧光蛋白、pHluorin与信号蛋白的表达体系，进行稳定遗传。

开展小分子信使（如离子、ROS等）的检测及其生物学功能研究；

发展SRET技术，实现检测多个蛋白相互作用的调控机理研究。

由于在心脏细胞等高度分化的细胞表达分子探针还有相当的困难，我们将先用细胞株和植物细胞进行筛选，条件成熟的探针可以构建腺病毒或慢病毒转染表达体系。

通过系统优化，我们将推动探针技术成为实验室常规技术，实现对信号蛋白及其相互作用的高时空分辨探测。

为深入阐述信号微观随机动态与系统稳态的相互关系，我们将在多种尺度上开展研究。

在分子水平上，研究重要信号蛋白的动态行为及相互作用；

在细胞器水平上，研究钙信号、ROS信号的动态及其与信号蛋白的相互作用；

在细胞水平上，研究钙信号螺旋波，钙信号与ROS信号相互作用，信号蛋白的空间定位和调控网络等；

在整体水平上，将采用基因敲除鼠和转基因鼠方法，研究信号蛋白的功能及其整合调控关系。

我们既在离体细胞研究信使分子的时空动态和信号转导，也在动物活体上观测分子信号的动态，将离体与在体研究相统一。

通过数学建模，将实验事实与生物学规律联系起来，通过对数据的拟合，建立细胞信使动态和稳态相统一的理论模型。

虽然系统的维数很大，但是通常只有几个反应是限速的（rate-limiting）。

我们可以通过限速反应、或某些“限速”的网络模块（module），发展基于信号传递或信息流的网络分解方法。

我们将基于反应扩散型偏微分方程、Ginzburg-Landau非线性偏微分方程等建立心肌细胞钙信号螺旋波的数学模型，开展对螺旋钙波动力学行为的研究。

以单分子米氏方程为基础建立单分子反应模型，进一步建立分子寡聚体系的数学动力学模型，通过MonteCarlo仿真获得分子寡聚体系动态行为。

我们将推广谢晓亮的单分子米氏方程理论，建立包含多类分子的反应通路的动力学，然后发展多尺度分子交互系统的理论。

本项目提托中关村地区的学术环境优势，发挥综合大学的多学科攻关优势，利用多个国家级研究基地的资源优势，包括生物膜与膜生物工程国家重点实验室、分子科学国家实验室、生物大分子国家重点实验室等。

因此，本项目承担单位具有良好的研究条件和研究基础。

承担本项目研究工作的中坚力量都是细胞信号动态研究、分子探针研究、新一代显微成像和多维图像处理等相关领域的学术带头人，拥有卓著的研究成果和丰富的研究经验，部分成员的研究在国际同领域居主导地位。

更为重要的是，本项目成员多年来保持密切交流和合作，不仅多次召开学术研讨会，还产生了多项重要合作研究成果。

为本项目攻关提供了强强联合、优势互补的学术团队。

3.创新点与特色：

本项目是根据国际研究前沿和热点，结合我国在细胞信号时空动态研究的特色和优势，针对可能获得突破的关键科学问题而提出的。

其创新性主要体现在：

（1）研究目标的创新。

本项目拟解决的关键科学问题是微观随机信号整合成细胞调控稳态的基本原理。

这是基于我们以往对细胞信号随机动态的深入研究，经过多次跨学科研讨，凝练出的科学问题，是生命科学、系统与控制科学、非线性物理科学领域共同关心的基本问题。

（2）研究思路的创新。

细胞信号过程是一个多层次复杂、动态体系。

深入研究这一动态体系中细胞信号的相互作用规律需要整合不同学科的优势。

我们在总体研究思路上，实验与理论相结合、分析与综合相结合、微观与宏观相结合、离体与在体相结合、随机与稳态相结合、科学探索与技术创新相结合。

用不同思路、从不同角度进攻同一关键问题。

（3）研究方法的创新。

研究细胞信号激活的时间、空间、幅度以及与上下游信号分子相互作用有很大的技术难度。

要获得突破性进展，很大程度上依赖于建立新技术和新方法。

本项目将充分利用项目组成员的研究特长，建立和发展高分辨率显微成像技术、基于拉曼光谱的新模态显微成像技术、基于非天然氨基酸的蛋白质标记技术、基于荧光蛋白的信号分子探针技术、光激活荧光蛋白及蛋白相互作用的动态检测技术、基因打靶技术、RNA干扰技术等新的综合平台，为深入揭示细胞信号时空动态创造得天独厚的实验条件。

本项目的显著特色是多学科联合攻关。

本项目的主要研究骨干来自北京大学生命科学学院、工学院、化学学院、数学学院，中科院生物物理所，中科院植物所，北京师大学和中南民族大学，汇聚了来自细胞生物学、生物物理学、分子生物学、生物信息学、化学、光学、数学、工学等多学科的专家，联合组成跨学科攻关团队。

团队中，生命科学专家提出关于生命活动信号调控的基本问题，并从分子、细胞到整体进行实验研究；

长期致力于生命过程研究的数学家以实验数据为基础，通过抽象、建模、仿真，对细胞信号时空过程的稳态机制进行理论升华；

化学生物学家通过设计分子探针，实现信号分子的动态和相互作用研究；

来自工学院的专家一方面为项目中成像技术和数据分析提供支撑，也将产生研究技术的自主创新成果。

4.课题设置

本项目围绕总体目标，设立六个课题组：

课题1细胞钙信号的时空特异性调控

研究容：

通过过去三十多年的不懈探索，细胞钙信号的微观性质已经逐步阐明，但这些信号如何控制并产生复杂的胞动态行为尚知之甚少，限制了对有关生理和病理过程的深入认识。

为此，本课题主要研究细胞钙信号的微观控制和时空自组织过程，包括钙火花发生过程中L型钙通道与钙释放通道间纳米尺度局部控制、钙火花通过钙致钙释放自激形成螺旋钙波和钙振荡的时空动态，同时与课题二合作研究细胞钙信号时空动态与超氧信号的相互关系。

研究目标：

本课题的总体目标是阐明细胞钙信号纳米尺度局部控制机制和细胞钙信号自组织机制，阐明单线态氧分子等超氧信号与细胞钙振荡的相互作用，从而对细胞钙信号异常如何导致心律失常等重大疾病这一长期未能阐明的问题提供新的分子病理机制。

承担单位：

北京大学、北京师大学

课题组长：

王世强

学术骨干：

崔宗杰

经费比例：

20%

课题2超氧炫与细胞ROS信号时空动态

ROS信号与细胞信号通路调节、应激反应、衰老、凋亡以及多种疾病密切相关，在生理和病理条件下都发挥重要作用。

尽管ROS信号研究历史悠久，制约ROS信号动态研究的主要原因是缺少特异性好、灵敏度高的ROS探针。

我们最新研究发明了一种特异于超氧阴离子的荧光蛋白探针cpYFP，利用该定位于线粒体的超氧阴离子荧光探针，我们发现了新的线粒体超氧生成事件，并命名“超氧炫（superoxideflash）”。

本研究将在此研究成果基础上，进一步发展在体实时探测ROS技术，并结合代谢模式转变的疾病动物模型，深入探讨ROS信号时空特性及其分子调控机制，从新的视野研究ROS信号的病理生理意义。

以超氧炫信号为基础，在整体动物水平实时监测正常生理代谢过程及有关病理过程中ROS信号的变化及其作用机制，探讨超氧炫信号用于诊断的可行性。

北京大学

晨

程和平、吴蓓

16%

课题3钙和ROS通路关键信号蛋白的可视化分析

本课题将以细胞的关键信号转导蛋白为研究对象，结合超高分辨率荧光成像、荧光相关光谱分析等技术，着重考察钙致钙释放信号蛋白复合体、AdR募集不同亚型磷酸二酯酶、ROS激活caspase和钙依赖性蛋白激酶等过程关键蛋白的动态和相互作用，阐释关键信号蛋白相互调控的分子机制。

通过设计和建立新的荧光蛋白表达体系及小分子荧光标记体系，对钙致钙释放信号蛋白复合体的寡聚状态、G蛋白耦联受体募集不同亚型磷酸二酯酶的时空动态过程、ROS激活caspase和钙依赖性蛋白激酶等过程实现可视化成像，阐明关键信号蛋白相互调控的分子机制。

系统优化的蛋白质特异标记技术也将为我国蛋白质研究提供一个新的独特的研究方法。

中国科学院植物研究所、北京大学

林金星

何川、笑宇

18%

课题4细胞多信号体系的整合调控

细胞生命活动功能受到众多信号分子的调控，如RyR、IP3R等钙通透性膜通道、AdR等受体及FKBP12.6、Yap、ROS、DJ-1等调节蛋白。

要维持细胞的正常功能，上述膜通道、受体、调节蛋白间构成相互调控的稳态体系。

本课题将制备基因干预动物模型，结合分子生物/生物化学、电生理及成像技术等现代技术，深入研究细胞多信号的相互调控，并阐明其整合机制.主要研究容有：

可遗传荧光分子探针动物模型；

钙信号与ROS信号的交互调控；

关键信号蛋白的遗传干预。

阐明FKBP12.6、junctin、yap、D-J1、CALHM1~2在调控钙信号和ROS信号协同稳态中的作用及分子机制，并阐明这信号蛋白调控异常与疾病发生发展的关系；

揭示心肌和血管平滑肌细胞钙信号、ROS信号与相关关键信号蛋白间的整合调控关系；

在整体动物上验证细胞多信号失调及钙信号紊乱与相关疾病的关系，并为发展防治相关疾病的药物创新提供理论基础。

中国科学院生物物理研究所、中南民族大学

姬廣聚

庆华、苗林、冯涓涓

14%

课题5信号分子时空随机性与介观行为稳健性

生命科学正在进入分子和细胞水平的定量研究，探索分子和细胞行为的理论模型具有重要意义。

活细胞是非常复杂的系统；

尽管生物分子在细胞的行为具有个体瞬时的随机性，然而细胞功能具有系统的稳健性。

本课题通过围绕细胞钙信号、线粒体ROS信号及相关关键信号蛋白构成的信号体系，以生物物理原理和统计、数学理论为基础，以理论分析、数值模拟和针对性的实验设计与验证为方法，通过对不同时空尺度变化的时空动态数据的分析建立理论模型，从控制和优化的角度研究系统的性质。

（1）建立信号分子寡聚体系随机动力学理论模型，阐释信号分子微观随机性与细胞信号系统介观稳健性的关系；

（2）建立细胞信号动态的数学模型，阐明其形成、传递、演变和终止的非线性动力学机制。

本课题基于项目组深入的研究工作和新颖的高分辨、高通量时空动态成像技术，提出了具有创新性的研究方案，有关研究对于深入认识生物功能多样性和稳定性具有重要意义。

姜明

陶乐天、远、建生

12%

课题6新模态、高分辨、高通量时空动态研究新技术

本课题“新模态、高分辨率、高通量时空动态研究新技术”的研究集中于发展与细胞信号时空动态观测相关的几个关键技术，用以定量化揭示细胞生命活动机制中的关键问题。

通过利用大规模RNA干扰筛选技术，筛选和确定在这些信号转导通路的关键分子，利用共聚焦显微镜、CARS、SRS等高分辨三维成像技术，进行时空动态示踪，详细阐释关键分子的作用机制，在光学显微观察技术上，引入相干拉曼散射作为成像的新模态，可以摆脱标记的困难，在显微图像的分析上，引入新的图像处理方法，提高可靠性。

通过和项目中其他课题的密切合作，开发和发展新的研究手段和方法，重点提供以高通量可视化的蛋白基因筛选、关键信号分子的非标记三维显微成像、荧光动态信号的图像处理为基础的新方法，为整个项目提供技术支撑，同时产生具有我国自主知识产权的细胞信号研究新技术。

席建忠

谢晓亮、黄岩谊、熊春阳

22%

5.课题间的关系

各课题围绕细胞信号动态这一国际前沿科学问题，在研究过程中紧密配合、优势互补，资源共享。

其中，课题一、二在我们以往突破性进展的基础上继续深入研究细胞钙信号和超氧炫的时空动态及其调控机制，是整个项目实现突破的基础。

课题三密切配合课题一、二，研究关键信号蛋白的分子动态和相互作用。

这三个课题构成了对微观信号时空动态的系统分析。

课题四、五在上述分析的基础上，分别以遗传干预等实验手段、建模仿真等理论手段，研究课题一、二、三中信号动态相互调控的稳态整合，重点揭示微观随机信号形成系统稳健性的基本原理，在实验研究的基础上产生理论升华。

课题六从成像技术和多维图像算法方面为整个项目提供技术支撑，同时产生研究相关技术的自主创新成果。

四、年度计划

研究容

预期目标

第

一

年

1.建立小鼠钙信号异常病理模型，研究细胞钙振荡和螺旋波的时空动态。

2.建立不同组织特异性表达超氧阴离子荧光蛋白探针cpYFP的转基因小鼠，和在体实时、原位监测超氧炫信号的技术平台。

3.构建光激活荧光蛋白与钙致钙释放蛋白复合体中有关信号蛋白的融合载体；

通过对分子聚集的时空动态的可视化研究，分析钙致钙释放蛋白复合体与RyR的关系。

4.应用基因编码荧光蛋白技术体系，建立有关信号分子的组织特异性基因编码荧光蛋白探针表达动物模型。

5.建立分子寡聚体系相互作用的米氏方程组；

发展针对时空动态数据的数据分析与建模工具；

研究细胞信号动态的数学模型，与实验数据进行比较，针对性的实验设计与验证。

6.针对ROS代谢信号分子，合成或者制备相应ROS分子的检测探针，并进行验证；

制备ROS代谢相关的siRNA；

建设CARS显微镜系统；

研究比较在共聚焦成像条件下活体细胞荧光微粒的荧光分布特征，通过引入非高斯分布参数的方法，探索高精度定位的方法。

1.阐明细胞钙信号自组织过程及其生理和病理意义。

2.建立不同组织特异性表达cpYFP的转基因小鼠，并利用激光共聚焦显微成像技术，在体水平检测到不同组织的超氧炫信号。

3.发展光激活荧光蛋白等特异标记技术；

建立在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞具有普适性的荧光蛋白标记方法，发展新的活体标记平台；

建立并完善SRET技术，实现多个蛋白相互作用的检测。

4.成功获取2-3个与调控细胞钙信号相关蛋白的遗传干预小鼠动物模型和可遗传分子探针的动物模型。

5.分子寡聚体系米氏模型；

从时空动态数据提取某些低维流形和稳健行为表示；

细胞钙信号动态的数学模型、初步的实验设计与验证。

6.建立筛选ROS代谢相关基因的细胞模型。

确定适合大规模细胞的种类、ROS信号检测或示踪探针以及siRNA转染的参数等；

建立不少于500条siRNA的文库；

完成CARS显微镜的建设，获取稳定的CARS信号，实现对脂类分子和亚细胞脂肪颗粒的实时观察。

二

1.研究肌质网钙释放通道突变对钙火花和螺旋钙波时空动力学特性，螺旋钙波的产生和发展的影响；

研究细胞ROS信号的产生，对细胞胞浆钙振荡发生及其振荡模式的影响。

研究ROS单线态氧分子对细胞表面G蛋白耦联受体介导的钙信号的调控作用。

2.利用cpYFP转基因小鼠模型，给予不同的处理，以改变其代谢状态，观察心肌、骨骼肌和肝脏中超氧炫信号的特性的变化，阐明超氧炫信号与代谢状态的关系，揭示超氧炫信号的生理意义。

3.应用非天然氨基酸标记、Sortase标记技术，对磷酸二酯酶高特异性标记；

对AdR募集磷酸二酯酶寡聚复合体进行可视化研究。

4.在基因编码荧光蛋白平滑肌和线粒体特异表达的小鼠模型上分析钙信号和超氧炫的时空特性及在高血压过程中的变化规律。

5.对分子寡聚体系米氏模型进行数值模拟和理论分析；

基于数值模拟和实验数据,发展从时空动态数据提取稳健行为的分析与建模方法；

改进细胞信号动态的数学模型，并与实验数据进行比较，针对性的实验设计与验证。

6.利用已有和公用软件，对筛选信息的进行整理和分析；

完成2000次筛选；

建设SRS显微镜系统；

采用基于数字体相关（DigitalVolumeCorrelation,DVC）技术的图像模式识别方法，实现对共聚焦荧光图像的自动分割、识别、匹配，利用小波分析的方法，对背景噪声进行局部消除。

1.阐明钙释放通道分子性质与钙火花及其自组织时空动力学的关系、以及CPVT分子病理机制；

阐明ROS信号对细胞胞浆钙振荡发生及其振荡模式的影响，阐述ROS单线态氧分子对细胞表面G蛋白耦联受体所介导的信号通路（钙振荡通路）的调控。

2.阐明超氧炫信号在不同的代谢状态下显示不同的特性，超氧炫信号是与代谢相关联的生理信号。

3.发展各类小分子标记技术；

揭示AdR局部信号转导的分子机制。

4.揭示心肌和血管平滑肌细胞钙信号、ROS信号与相关关键信号蛋白间的整合调控关系，以及钙信号稳态失调所致相关疾病的分子机制。

5.分子寡聚体系米氏模型理论；

刻画米氏模型介观稳定性的控制和优化参数；

改进的细胞信号动态数学模型以及进一步的实验设计与验证。

6.找到三到五个新的ROS代谢调控因子，并利用Northern、Western等方法进行验证；

对相干拉曼光谱的激发光进行调制，实现受激拉曼散射，完成SRS显微镜的建设，并利用SRS显微镜对脂类分子和亚细胞脂肪颗粒实现非标记实时定量图像检测；

实现噪声背景下共聚焦目标荧光图像的快速识别、匹配。

三

1.以2肾上腺素受体介导的cAMP-PKA为例，研究G蛋白耦联受体局部调节细胞钙信号的分子机制；

研究细胞主要表达的TRP通道类型及亚细胞定位；

研究ROS单线态氧分子对细胞Ca2+-ATPase功能的调节，及所导致的Ca2+-ATPase氧化修饰。

2.利用cpYFP转基因小鼠模型，在体监测代谢疾病小鼠骨骼肌中的超氧炫信号变化，研究ROS信号在代谢疾病的作用，并研究大脑神经元中超氧炫信号的变化，探讨超氧炫信号在诊断、治疗代谢和神经疾病中的作用。

3.应用小分子探针标记，标记钙离子信号和ROS信号分子；

将钙离子探针与线粒体蛋白特异结合，对线粒体ROS与钙相互作用进行实时动态研究。

4.应用基因打靶、基因编码等技术，通过对细胞信号转导进行遗传干预，研究细胞生命活动过程的分子机制，分析信号间的调控关系。

5.改进分子寡聚体系米氏模型，刻画其亚稳态行为；

基于相关实验数据，发展时空动态数据提取的分析与建模方法；

针对细胞信号动态的数学模型，研究模型参数和分布函数的反演方法。

6.完成总共5000次筛选；

详细研究两到三个功能基因的分子作用机制；

利用CARS和SRS显微镜进行活细胞的实时动态观察；

研究提高共聚焦图像分辨率的图像处理方法。

1.阐明胞膜窖中G蛋白、钙信号蛋白、激酶、磷酸二酯酶空间募集与局部信号控制的关系；

阐明细胞主要表达的TRP通道，及核定位的TRP通道。

了解ROS单线态氧分子对细胞Ca2+-ATPase的氧化修饰调节。

2.超氧炫信号特性在代谢疾病中发生明显改变，有可能作为诊断、治疗代谢疾病的靶点；

超氧炫信号特性在神经性疾病中发生明显改变，有可能作为诊断、治疗神经性疾病的靶点。

3.实现小分子探针对钙离子信号的可视化标记；

确定钙信号发生的精确位置。

4.阐明细胞多信号体系相互调控钙、ROS信号的分子机制，为相关疾病的防治提供理论基础。

5.改进的广义米氏模型；

刻画广义米氏模型介观稳定性的控制和优化参数；

数据驱动的细胞信号动态数学模型的模型参数和分布函数的确定方法。

6.初步掌握两到三个基因体外和细胞的作用机制证据；

初步实现细胞的显微镜下实时动态培养和CARS/SRS的实时动态观测；

建立共聚焦荧光成像系统的点扩散函数模型，实现反卷积方法，提高图像分辨率。

四

1.研究钙小星触发钙火花过程中钙释放通道的时空募集过程，建立随机动力学