CCK8操作说明和检测步骤Word格式.docx
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CCK8操作说明和检测步骤Word格式.docx
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5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7.如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
注意:
如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。
当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
制作标准曲线1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。
2.按比例(例如:
1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。
3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。
根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。
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WORD完美格式编辑DOJINDO检测步骤CCK-8检测步骤1.向各孔中加入100μl细胞悬液。
a)2.在37℃下预孵育培养板。
b)3.向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10μl。
4.37℃下孵育。
5.向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。
6.37℃下孵育1-4小时。
e)7.测定450nm处的OD值。
a)使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。
b)建议使用CO2培养箱过夜预培养。
c)使用培养基或PBS来制备溶液。
d)如果待测溶液有还原性,测定不含细胞,但含有CCK-8的待测溶液在450nm处的空白吸光度。
如果该吸光度很小,则可以直接加入CCK-8,如果吸光度相对较大,则需要除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的100μl培养基和10μlCCK-8进行检测。
e)白细胞可能需要培养较长时间。
活力计算细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×
100A(加药):
具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度A(空白):
具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度A(0加药):
具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力:
细胞增殖活力或细胞毒性活力问答:
1.一个孔中应接种多少个细胞?
当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。
检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。
如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
2.能否用384孔板进行试验?
可以。
向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量。
WORD完美格式编辑3.能否用24孔板进行试验?
向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4.酚红会影响检测吗?
不会。
培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性?
有。
然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。
6.CCK-8能否检测细菌细胞?
可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。
向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液,并培养1-4个小时或过夜。
7.CCK-8稳定吗?
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。
如果需要长期保存,我们推荐-20℃的储藏条件。
8.如果没有450nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片?
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差?
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10.CCK-8是什么颜色?
应该是粉红色。
若颜色不一样,有可能会影响测定。
11.CCK8能否对活细胞进行染色?
不能。
因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST8),并通过电子载体1MethoxyPMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。
由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能对细胞进行染色。
12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒?
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WORD完美格式编辑CCK8溶液自身因为高浓度的1MethoxyPMS的存在而具有一点毒性。
但是,加到培养基中的CCK8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。
因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。
同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。
由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。
13.在做加药实验时,药物对测定是否有影响?
如何解决?
有时会有影响。
如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。
解决办法:
首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK8之前更换培养基,去掉药物的影响。
14.每次测定的数值不一样,是什么原因?
可能会有以下几个原因:
1.当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。
一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
2.有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3.每孔的细胞数量过多或过少。
请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。
15.如何设定空白对照?
在不含细胞的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。
在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。
16.哪些物质会影响CCK8的测定?
当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。
在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。
17.在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?
可以缩短加入CCK8后的培养时间。
例如:
可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
18.设定参比波长的目的是什么?
必须设定吗?
不一定要设定。
CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。
设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
19.说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板货12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?
…专业资料整理
WORD完美格式编辑一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
20.在CCK-8显色过程中,如何终止反应?
有一下几种方法(96孔板):
1、在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。
2、每孔加10μl0.1MHCL溶液。
3、每孔加10μl1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。
反应停止后,应在24小时之内测定。
21.必须预培养细胞吗?
不一定。
如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。
如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。
也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
22.如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?
金属对CCK-8显色有影响。
当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。
如果终浓度是10Mm的话,将会100%抑制。
23.CCK-8试剂的保存条件?
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。
如果需要保存较长时间的话,推荐在-20℃下保存。
但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
24.预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。
如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
25.CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?
不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。
对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
26.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?
悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。
27.应该每次做标准曲线吗?
建议每次做。
虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建专业资料整理
WORD完美格式编辑议每次做标准曲线。
如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。
28.有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?
…不能。
由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。
29.实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应?
建议使用一个孔作一下检测,因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。
一般正常在的OD值应该在0.4以下。
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