最新基因工程复习提纲完善Word文档格式.docx
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基因工程在环境保护中的应用
1.检测水污染2.生物降解
7.核酸酶的分类
1)根据核酸底物分
RNA酶(Rnase)/DNA酶(Dnase)/底物非专一性核酸酶;
2)根据作用方式分
内切核酸酶(endonuclease)/外切核酸酶(exonuclease);
3)根据对底物碱基专一性分
碱基专一性核酸酶(切割部位的碱基序列高度专一性)
非碱基专一性核酸酶(切割部位的碱基序列随机性)
8.细菌中的防卫系统:
限制与修饰现象。
(1)细菌在其感受态的生理条件下,很容易吸收外源DNA进入体内。
这种感受态可以是人为的,也可以是在自然条件下发生的。
如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA,细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。
(2)限制性核酸内切酶:
可以帮助细菌限制外来DNA的入侵
(3)甲基化酶:
对该特异位点的碱基进行甲基化修饰,被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。
(4)细菌自身的DNA——受到甲基化修饰,得以保存。
(5)外源入侵的DNA——未来得及甲基化,被降解。
9.作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌(如DH5α)的必须条件
(1)rec基因缺陷型的突变体,保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组;
(2)限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株,保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。
10.限制性核酸内切酶
(1)最重要的是哪一类?
II型
(2)命名
(3)II型限制性内切酶的基本特征
1.识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列
2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
4.某些限制酶在非标准反应条件下,可能导致酶的识别序列特异性发生改变
(4)回文结构
序列正读和反读是一样的,即有一个中心对称轴,从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。
(5)限制性内切酶形成的末端结构
粘末端:
两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列,这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段;
平末端:
两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。
(6)Staractivity
一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变,如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件,酶切割位点专一性发生改变。
(7)同裂酶:
一类来源不同,但识别靶序列相同,切割位点可以相同也可以不同的酶。
(8)同尾酶:
一类来源不同,识别靶序列不同,但是都产生相同的粘性末端的酶。
(9)同位酶:
一类识别靶序列相同,但切割位置不同的酶。
(10)限制酶的识别序列与DNA的来源无关,不带有种的特征,对各种DNA都普遍适用;
(11)在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌(识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性)
11.DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I(DNApolI)的用途:
缺口平移(Nicktranslation)
5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用,使缺口向前推进
(2)大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)
性质:
Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。
用途:
补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端/cDNA第二链的合成
(3)T4-DNA聚合酶
性质:
5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性/在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切/在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸暴露时停止/在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位
切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端
(4)依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)
基本特性:
以RNA为模板聚合cDNA链/双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
主要用途:
将真核基因的mRNA转录成cDNA,构建cDNA文库/对具有5‘突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针
12.DNA连接酶:
形成磷酸二酯键(DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分)
(1)防止连接反应中载体或目的基因的自我环化
1.双酶切2.碱性磷酸酶去除5’-P3.调整反应物比例(P102)
(2)平末端DNA片段的连接方法
1.直接用T4DNA连接酶连接(需ATP和高浓度酶,效率不高)
2.TdT同聚物加尾法
3.用衔接物连接平末端DNA分子(T4DNALigase)
3.DNA接头连接法
11.核酸酶(nuclease)
(1)单链核酸内切酶——S1核酸酶的
基本反应:
内切单链DNA或RNA/内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA
去除DNA片段的单链突端,使之成为平端/去除cDNA合成时形成的发夹结构/施行S1核酸酶保护实验,分析转录产物/成熟mRNA与基因组DNA杂交后,结合此酶水解,可定位内含子/修整渐进性删除突变的末端
(2)单链内切、双链外切的核酸酶:
Bal31核酸酶
特性:
从双链DNA的两端3‘和5’同时开始水解两条链,对两条链的水解速度不一定相等,结果是双链从两头缩短,彻底水解为5‘单核苷酸。
12.核酸修饰酶(NucleicAcidmodificationenzymes)
(1)末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)
不需要模板的DNA聚合酶,在3’端随机掺入dNTPs
给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾/DNA片段3’末端的同位素标记
(2)碱性磷酸单酯酶(CIP、BAP)
反应:
去除5’-P,成为5’-OH
目的:
1.去除载体DNA5’端磷酸,防止载体自身环化,提高重组率
2.去除DNA和RNA的5’-P,然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。
(3)T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)
催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’-OH末端上
用于探针的末端同位素标记
13.核酸凝胶电泳结果处理软件:
quantityone(了解)
14.基因克隆载体:
概念:
能够运载外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞,具有自我复制能力,使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达,不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子
种类:
质粒(plasmid)/噬菌体或病毒DNA/考斯质粒(cosmid)与噬菌粒/人造染色体载体
功能:
1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
应具备的条件:
1.可转移性:
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
2.具有与受体细胞相适应的复制位点(ori,originofreplication)或整合位点
3.具有较高的外源DNA的装载能力
4.多克隆位点(multiplecloningsite,MCS):
具有多种限制性内切酶的单一切点
5.具有合适的筛选标记(selectionmarker)
6.安全,不含对受体细胞有害的基因,不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中
(1)质粒:
质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制,并被稳定遗传的一类核酸分子。
天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,即cccDNA
(2)什么是质粒的不相容性及其机制;
不相容性:
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性,不相容性的质粒组成不相容性群。
机制:
两种含有不同复制子结构的质粒,在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节,致使两种质粒的最终拷贝数恒定,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。
两种含有相似复制子结构的质粒,在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争,致使两种质粒的最终拷贝数不同,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。
(3)根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型(严紧型和松弛型),其中氯霉素的作用(蛋白质合成抑制剂,使染色体DNA合成受阻,松弛型继续扩增,极大提高拷贝数);
根据是否可以在细胞间转移,质粒可以分为(结合型和非结合型);
(4)质粒的性质
自主复制性(质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制)、不相容性、可转移性
(5)一个合格质粒的组成要素
1.具有复制起始位点(Ori)或整合位点
2.具有两种易被检测的选择性标记(抗生素抗性基因)
3.具有多种限制酶的单一识别位点(多克隆位点MCS)
4.具有尽可能小的相对分子质量
5.属于松弛型复制
6.属于非传递型质粒
7.具有较高的外源DNA装载能力
8.P/E(Promoter/Enhancer):
启动子/增强子
9.T(Terminator):
终止信号
10.poly(A)加尾信号:
稳定mRNA
(6)如何阅读质粒图谱
(7)重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322
松弛型复制/氯霉素可扩增/拷贝数每细胞50-100/用于基因克隆
pUC18/19
拷贝数2000-3000/cell
装有多克隆位点(MCS)
正选择颜色标记lacZ’(E.coli的lacZ基因的5’-序列,表达半乳糖苷酶的α片段。
LacZ’的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O)
用于基因克隆和测序
(8)蓝白斑筛选:
α互补效应
pUC18/19质粒上的LacZ基因包括:
一段β-半乳糖苷酶的启动子、编码α肽链的区段、一个MCS。
MCS位于编码α肽链的区段中,是外源DNA的选择性插入位点,但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
当菌体中含有带lacz‘的质粒后,质粒lacz’基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补,具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用,使X-gal生成蓝色物质,这种现象即α-互补。
用这种质粒进行克隆时,如果外源基因破坏了LacZ的编码序列,所产生的蛋白产物就会丧失α-互补能力,在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑,可用于重组子的筛选。
(9)碱裂解法制备质粒中溶液I、II、III的作用
溶液I:
调节pH,悬浮菌体,抑制DNase的活性
溶液II:
裂解细胞膜(主要是NaOH),临用前配制,SDS是为沉淀染色体DNA作准备
溶液III:
中和NaOH,促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA
(10)质粒改造策略
删除不必要的DNA区域,缩小分子量,提高外源DNA片段的装载量。
灭活某些质粒的编码基因。
加入易于识别的选择标记基因。
选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列---多克隆接头(Polylinker)。
加入特殊的基因表达调控元件。
15.大肠杆菌的λ噬菌体DNA的两种状态:
溶原状态和溶菌状态,DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入(溶菌状态)。
(1)λ噬菌体DNA载体的类型及装载容量:
野生型l-DNA包装的上限为51kb
插入型载体:
自身长37kb,装载容量0kb-14kb
取代型载体:
自身长26kb,装载容量10kb-25kb
λ噬菌体DNA载体的优点
λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒,能高效转染大肠杆菌
λ-DNA载体的装载能力为25kb,远远大于质粒的装载量
重组λ-DNA分子的筛选和提取均较为方便
λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段,但不适合表达外源基因
16.什么是考斯质粒(cosmid),其装载容量?
考斯质粒:
一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
装载容量:
30kb-45kb
17.噬菌粒(phagemidorphasmid)及其装载容量
噬菌粒:
一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。
装载容量
BAC:
50kb-300kbYAC:
350-400
18.人造染色体载体主要包括哪两种。
BAC&
YAC
19.基因克隆受体细胞应具备的条件
1.限制性缺陷型
2.重组整合缺陷型
3.具有较高的转化效率
4.具有与载体选择标记互补的表型
5.感染寄生缺陷型
常用的基因克隆受体细胞
1.大肠杆菌
2.酵母菌:
酿酒酵母和毕赤酵母
3.哺乳动物细胞:
CHO
20.核酸序列分析:
DNAMAN(了解)
21.目的基因的克隆方法
基因分离的物理方法/鸟枪法/cDNA法/PCR法/化学合成法
22.什么是鸟枪法克隆目的基因
(1)鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离(不能除去真核生物基因中的内含子结构)。
(2)鸟枪法克隆目的基因的基本步骤。
染色体DNA的切断-->
与载体连接-->
转化受体细胞-->
筛选含有目的基因的重组子
(3)鸟枪法克隆目的基因过程中染色体DNA切断的方法。
超声波处理:
片段长度均一,大小可控,平头末端。
全酶切:
片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控。
部分酶切:
片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整。
23.什么是cDNA法克隆目的基因
cDNA法是以mRNA为模版,用反转录酶合成互补DNA的方法。
(1)cDNA法克隆目的基因中cDNA第二链的合成方法有哪几种:
自身引导法、置换合成法、引导合成法(获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列)。
(2)cDNA法克隆目的基因的局限性:
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;
细菌或原核生物的mRNA半衰期很短;
mRNA在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难;
仅限于克隆蛋白质编码基因。
24.基因库与基因文库
(1)概念
基因库:
特定生物体基因组上所有基因的集合(天然存在)。
基因文库:
从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。
(2)基因组文库:
含有全部基因
(3)cDNA文库:
含有全部编码蛋白质的结构基因
(4)基因文库构建的基本策略
基因组文库:
鸟枪法构建,材料来自染色体DNA
cDNA文库:
cDNA法构建,材料来自mRNA
cDNA文库的信息量远小于基因组文库。
(5)基因文库的完备性
(6)cDNA文库组建步骤
25.化学合成法克隆目的基因
(1)化学法全基因合成的策略:
小片段粘接法、补丁延长法、大片段酶促法
(2)DNA化学合成的用途:
合成天然基因;
修饰改造基因;
设计新型基因;
制备探针、引物、接头等。
26.实验技术(了解):
Gateway技术(Invitrogen)、In-FusionPCR技术(TaKaRa)、Bioedit软件
27.PCR技术的原理
在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。
一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。
(1)类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于寡核苷酸引物
(2)PCR过程:
由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
①变性:
94℃左右,使双链DNA模板解离成为单链;
②复性:
55℃左右,引物与模板DNA单链互补配对结合;
③延伸:
72℃左右,“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成新的DNA链。
(3)重复“变性--退火--延伸”的循环,可获得大量的新DNA链,而且这种新链又可成为下次循环的模板,从而指数级地获得大量DNA产物,数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
28.PCR技术依据的生物学理论:
碱基互补配对原理、半保留复制原理
(1)PCR技术依赖于DNA的变性和复性
DNA的变性:
加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA。
DNA的复性(退火):
解除变性的条件后,变性的单链DNA可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复。
29.PCR反应体系的组分及反应程序(PPT有实例)
30.PCR反应条件
(1)引物
①引物长度:
约16-30bp,太短影响引物与模板的配对
②四种碱基随机分布,在3’端不存在连续3个G或C,这样易导致错误引发(falsepriming)
③引物中G+C含量:
通常为40-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度——Tm=4(G+C)+2(A+T)
④引物3’端:
关键碱基,必须与模板完全配对,最好对应密码子的第一或第二位核苷酸,以减少由于密码子摆动产生的不配对
⑤引物内部:
尤其在3’端,不存在发夹结构(Hairpin)、二聚体(Dimer);
⑥两引物之间:
尤其在3’端,不能互补以防出现引物二聚体(crossdimer),减少产量;
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性
⑦引物5’端:
对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。
通常应在5’端限制酶位点外再加3-4个保护碱基
⑧引物不产生falsepriming:
不与模板结合位点以外的序列互补,避免错误引发PCR扩增
(2)DNA聚合酶:
一般PCR中聚合酶的出错率为1×
10-5/每碱基对;
普通聚合酶(A末端)和高保真聚合酶(平末端)
(3)Mg2+的作用
DNA聚合酶的激活剂,可影响酶的活性和真实性,还影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团(如磷酸基团、EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质),以保证最适Mg2+浓度
(4)PCR中延伸补齐的作用:
72℃,5min—10min
31.PCR的类型(了解):
不对称PCR、反向PCR(reversePCR)、多重PCR(复合PCR)、LP-PCR(Labelledprimers)、锚定PCR(anchoredPCR,A-PCR)、原位PCR、反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR(real-timePCR)、
32.PCR技术的应用:
基因克隆、遗传病的诊断、恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)诊断、基因鉴定
33.PCR法获取目的基因的两种基本策略:
T载体、酶切位点(其他:
Gateway技术、In-fusion技术),见补充。
34.基因克隆操作的基本过程
(1)DNA的体外重组
(一)——切
工具:
限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)
作用对象:
目的基因片段、载体
获得具有互补粘性末端(或平末端)的线性目的基因片段和线性化载体
酶切反应体系及条件(PPT有实例);
(2)DNA的体外重组
(二)——接
DNA连接酶(DNAligase)
具有互补粘性末端(或平末端)的线性目的基因片段和线性化载体
获得含有目的基因的环状载体
DNAligase介导的体外连接的反应体系及条件(PPT有实例);
DNA体外重组后,有时需要鉴定目的基因的连接方向;
同尾酶切割形成的粘性末端相互连接后,目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点
(3)重组DNA分子的转化
Ca2+诱导的转化
原理:
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌,1970年建立。
其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态叫做感受态。
处于感受态的细菌,容易接受外源DNA。
关键点
1.转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%;
2.热击过程中不要摇晃离心管;
3.检测转化子的Amp抗性时,转化子铺平板时密度应低一些(104菌落/板);
转化子于37℃培养不要超过20小时。
因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现对Amp敏感的卫星菌落。
4.转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高,为得到较高的转化效率,应使转速小于225rpm。
5.当用于涂板的转化液过多时,应离心浓缩(4100rpm,5min),并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。
6.刚进行完转化的菌体比较脆弱,涂板时应轻轻涂布。
感受态细胞其他转化方法(细菌原生质体的转化,针对Gram-n、λ噬菌体DNA的转染、电穿孔转化);
转化率的概念及相关计算
每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。
由于在一般的转化实验规模下,每个受体细胞最多只能接受一个载体分子,因此转化率的定义也可以表征为:
每微克载体DNA转化后,能够接纳DNA的受体细胞数目,即克隆数(在筛选时,未接纳载体或重组子的受体细胞无法生长)
计算实例
(4)转化子的筛选和鉴定(检)
载体遗传标记检测:
抗药性筛选法(氨苄青霉素:
Amp或Ap;
卡那霉素:
Kan;
壮观霉素:
Sp;
四环素:
Tc)、营养缺陷型筛选法、显色筛选法、
克隆DNA序列检测:
限制性酶切图谱法、菌落/噬菌斑原位杂交法(了解)、DNA序列分析法(了解)
外源基因产物检测:
蛋白质生物功能测定法、蛋白质生物结构鉴定法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
35.重组率的定义(含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数,一般
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