感受态细胞的制备质粒DNA的转化与提取Word文档下载推荐.docx
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5.4℃,4000rpm离心10min搜集细菌,倒出上清,再用4mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌,这些细菌能够当即便用,或于4℃放置12~24h以增加其敏感性后利用。
6.若是证明所制备的感受态细胞可用,能够在冰上分装为100μL每管,再加入100μL甘油(注意:
甘油超级粘稠,吸取时应该多一点。
),于液氮或-70℃冰箱中寄存。
存于低温下的感受态细胞,必然不能融解。
若是已经融解,应抛弃,而不能再冻结保留而继续利用。
注意事项:
1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。
空白菌能够于平板上划线后,用Parafilm包好后存于4℃,也可将液体培育物存于4℃。
但如果是要长期保留,则应将细菌保留于50%的甘油中,存于-20℃或-70℃。
当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃寄存的液体培育物时,接种应迅速,不等解冻,当即从表面刮下一块冰后,将菌种迅速放回低温寄存;
2.一般于3mLLB培育基中留宿培育12h后,菌体已很浓,能够进行扩大培育。
于100mL培育基中培育2~3h后,即可达到对数生长期。
但有时若是由于寄存太久,或已通过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时刻会延长;
3.对OD值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取3mL测OD值。
开始能够每30分钟检测一次,越到后面检测的时刻就应该缩短;
4.感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。
因此,所有操作均应在超净台上。
也能够在实验台上进行,但应在后面放一酒精灯,所有操作都不能远离火焰。
最好每次恰好做感受态之前,将所有的枪头和管子都灭一下菌,用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍;
5.感受态细胞的细胞膜比较脆弱,因此一当用冰凉的CaCl2悬浮以后,即不能猛烈震荡或快速抽吸;
6.按照咱们的经验,纯度较高的含结晶水的CaCl2能够取得好的实验结果;
7.所有的枪头和管子均应干净。
若是有可能,都尽可能用新的。
若是是用的回收的枪头,必然要看管壁是不是干净。
8.扩大培育用的液体培育基体积能够调整。
调整后的CaCl2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。
9.以本方式制备的感受态细胞的感受效率将随低温保留时刻的延长而下降,所以最好是现做现用。
存于低温下的感受态细胞应该在一个月内利用。
而对于转化PCR连接产物,建议用其它的感受效率更高的制备方式。
本节后的附4介绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方式。
质粒DNA的转化
见感受态细胞的制备;
—LB固体培育基:
于液体培育基中加入%的琼脂粉。
不用在灭菌前溶化琼脂粉,灭菌完后,轻轻摇匀。
注意不能猛烈摇动,不然可能会使培育基暴沸;
—LB平板:
将灭菌后的固体培育基冷至60℃左右时,倒入90mm的培育皿中(约30mL。
若是先前已加入了抗生素,则还应在超净台上晃动培育皿几回;
—200μL枪头,mLEp管,灭菌;
—42℃水浴;
—10μL,200μL加样枪;
—恒温摇床,恒温培育箱;
—菌液推棒;
—抗生素储液,本实验室所有的质粒挑选所用的抗生素有两类,氨卞青霉素(Amp)(储液,100mg/mL,溶于无菌水中,工作浓度100μg/mL,即每毫升培育基取1μL储液);
四环素(Tet)(储液,5mg/mL,先用1/2体积的乙醇溶解,再加入1/2体积的无菌水,工作浓度50μg/mL,即每毫升培育基取10μL储液。
储液全数于-20℃保留);
—冰;
1.若是是冻存的感受态细胞,先于冰上溶解;
2.加入用于转化的质粒DNA1μL;
3.冰上放置30min;
4.于42℃热击60s;
5.迅速放于冰上,5min后进行下一步;
6.将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培育试管,该培育试管有已预热至37℃的LB液体培育基,使整体积为1mL,温和震荡(200rpm左右)培育1h;
7,将苏醒的培育物倒入一Ep管中,4℃,4000rpm离心10min,将培育基倒掉,用残留的培育基悬浮,然后用加样枪将菌液加到LB平板上,用推棒涂布直至培育基表面无可见的液体,将有培育基的一面向下培育约30min后,倒置培育留宿。
1.热击时刻要按照所用管子的传热效率,薄壁管子的传热效率高,热击时刻能够缩短到45s;
2.热击时,要使水浴尽可能不要流动,热击后应迅速放回冰上;
3.于37℃苏醒细菌时,不能加抗生素,摇动也不能太过于猛烈;
4.对照的设置对于评价转化结果超级重要,将10μL感受态细胞别离涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上,若是感受态细胞没有问题,则应该在不含抗生素的平板上生长,而在含有抗生素的平板上不能生长。
5.一般转化细胞能够用其中的1/3涂布一个平板,2/3涂布一个平板。
不过,对于多拷贝质粒,也能够不用离心,取50μL涂布一个平板足矣。
质粒DNA的提取
—储液:
100mL1mol/LTris-HCl(pH:
称取Trisg,用浓HCl调节pH为,然后定溶至100mL,灭菌后存于4℃;
100mLmol/LEDTA(pH:
称取g二水乙二胺四乙酸二钠,加80mL去离子水,加热溶解,用固体NaOH调节pH为,然后定溶至100mL,灭菌后存于4℃;
100mL10%SDS,称取10g十二烷基硫酸钠于80mL去离子水中,加热溶解后存于室温;
2mol/LNaOH10mL,称取g固体NaOH溶解,定溶至10mL,于塑料瓶中室温寄存,能够不灭菌。
—溶液I:
每配制100mL,称取葡萄糖g(50mmol/L),1mol/LTris-HCl(pHmL(25mmol/L),mol/LEDTA2mL(10mmol/L),定溶至100mL,灭菌后存于4℃;
—溶液II:
现用现配,每100μL需要2mol/LNaOH10μLmol/L),10%SDS10μL(1%),然后加80μL无菌水;
—溶液III:
每100mL称取KAc,于70mL去离子水中溶解,然后加入冰乙酸mL,定溶至100mL后,灭菌存于4℃;
—TE(pH:
每100mL取1mol/LTris-HCl(pH储液1mL(10mmol/L),mol/LEDTA(pHmL(1mmol/L),定溶至100mL后,灭菌存于4℃;
—无DNase的RNaseA:
将RNaseA溶于10mmol/LTris-HCl,15mmol/LNaCl中,使终浓度为10mg/mL,于100℃加热15分钟,缓慢冷至室温,然后存于-20℃;
—Tris饱和酚(pH;
—氯仿/异戊醇(24:
1);
—100%乙醇与70%乙醇,均于-20℃寄存;
—mLEp管,200μL及1mL枪头,灭菌;
—40μL,200μL,1mL加样枪;
—滤纸,mLEp管;
1.接种一单菌落于3mL含相应抗生素的培育试管中,于37℃猛烈振荡培育留宿;
2.将全数培育物分两次倒入mLEp管中,12000g离心1min搜集细胞;
3.将Ep管倒置于一干净滤纸上,将培育基尽可能流尽;
4.将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I中,猛烈振荡使细菌沉淀分散;
5.加400μL新配制的溶液II,盖紧管口,轻柔的快速倒置Ep管5~10次,然后将Ep管于冰上放置5min;
6.加300μL用冰预冷的溶液III,盖紧管口,将Ep管倒置混合15次左右,然后将Ep管于冰上放置5min;
7.2℃,12000g离心5min,将上清转入另一Ep管,加等体积的酚/氯仿,振荡混匀,2℃,12000g离心5min;
8.吸出上清,再加等体积的氯仿抽提;
9.在吸出的上清中加入2倍体积冰凉的乙醇于室温沉淀2min;
10.2℃,12000g离心5min,倒出上清,沉淀用70%乙醇洗两次。
然后倒置于一滤纸上,让乙醇挥发干净;
11.高拷贝质粒溶于含5μLRNaseA的50μlTE中;
低拷贝数质粒减半。
1.细菌培育时刻不宜太长,一般以12~16h为宜,若是培育时刻太长,培育物会超级粘稠,这会致使离心沉淀的困难;
2.一般细菌培育好以后,应该马上提取。
若是不能马上提取,于4℃寄存时刻不能太长;
2.加溶液I分散细菌沉淀比较关键,若是分散不好,将直接影响产率;
3.溶液I加入后,溶液会超级浑浊,加入溶液II倒置几回后,溶液变清,打开管口,会发觉溶液呈鼻涕样,加入溶液III倒置后,会发觉有沉淀物形成,该沉淀物位于溶液上层。
若是发觉沉淀不能自动聚集,而是呈烂棉花状,且离心后不能沉到管底,则预示实在验的失败;
4.培育基的成份超级复杂,若是去除得不太干净,则有可能影响到后面的酶切效果;
5.乙醇必需去除干净,不然会造成电泳点样时上漂;
但样品又不能干燥太久,不然有可能使得质粒DNA沉淀难于溶解在TE中。
6.SDS在低温下会析出结晶,因此配制溶液II时应先于60℃溶解;
7.若是一次要提多个样品,能够先一路配制溶液II,而后加入每管。
但配制时应略大于所需要的量;
附:
1.苯酚的平衡
—重蒸苯酚
—8-羟基喹啉
—水浴锅
—固体Tris
—50mmol/LTris-HCl(pH:
称取6.055gTris,溶于800mL蒸馏水中,用浓HCl调pH为,定容到1L。
1.将重蒸酚于65℃水浴融化;
2.取100mL融化的重蒸酚于一250mL烧杯中,马上加至少等体积的蒸馏水,同时加入%苯酚体积的8-羟基喹啉,然后加入少量的固体Tris,当Tris溶解后,可看到液面分层出现,加Tris用~的精密pH试纸调pH为(待加入的Tris溶解充分后,停止搅拌,待分层完全出现后,再用pH试纸测上相的pH值)。
3.将上清吸出,加入100mL50mmol/LTris(pH,充分搅拌后,测定上清的pH值。
若是不到,则还需要调节。
4.将上清吸出,再加入100mL50mmol/LTris(pH,充分搅拌后,吸出上清,但要在液面上保留一层液体。
倒入棕色瓶中,于4℃保留。
如此的饱和酚能够利用2个月。
若是超出2个月,则应倒入专用的盛装回收酚的棕色瓶中,再从头平衡。
注意:
1.酚有强烈的侵蚀性,所以操作时必然要小心,注意不能溢出或溅出,而且要戴手套。
若是不小心溅到皮肤上,用大量的水冲洗,切忌用乙醇!
!
2.由于酚的侵蚀性,所以不用pH计调pH值,只能用pH试纸。
3.Tris必然要溶解充分后,再测定pH值。
2.核酸样品中蛋白质的去除
—3mol/LNaAC(pH):
称取gNaAc·
3H2O或无水NaAcg,溶于30mL水中,加HAc调pH至,用水定溶至100mL(调pH时,愈到后面,愈应小心)。
然后灭菌存于4℃。
若是是浓缩RNA,还要用DEPC处置后再灭菌。
—枪头和管子:
按照纯化样品的不同而采取不同的处置方式,纯化DNA时只需灭菌,纯化RNA时则需要DEPC处置后再灭菌。
—冻存于-20℃的无水乙醇和70%乙醇
1.在核酸样品中加入1/2样品体积的Tris饱和酚和1/2样品体积的氯仿/异戊醇,混匀后,于2℃,12000rpm离心5min,将上清转入一新管中,重复酚/氯仿抽提直至界面无可见的沉淀物为止。
2.加入1倍样品体积的氯仿/异戊醇,混合均匀后,于2℃,12000rpm离心5min,将上清转入另一新管。
3.加入1/10终体积的3mol/LNaAC(pH),再加入2倍体积的冰凉的无水乙醇,于-20℃至少沉淀3h。
4.2℃,12000rpm离心15min。
沉淀用70%的乙醇表面润洗2次,将管倒置于一滤纸上,空气中干燥。
然后将样品溶于适量体积的溶剂中。
1.混匀方式要按照DNA和RNA而有所不同:
RNA混匀时,能够猛烈震荡,而DNA只能用手倒置混匀。
2.吸取上清液应按照待纯化的样品是DNA仍是RNA而有所不同:
DNA吸取要缓慢,RNA则能够不加注意。
3.所加乙醇的体积是以加了盐后的体积计算的。
4.若是待纯化的核酸样品量太少(<
1µ
g)或样品太稀(<
µ
g/µ
l),则所加乙醇的量应扩大到~3倍。
3.核酸的浓缩
以上所述的去除核酸中的蛋白质后,再用乙醇沉淀即为核酸的浓缩。
若是核酸样品已经很纯,则沉淀时无必要加入醋酸盐;
若是核酸样品中还有杂质需要去除,则还应加入醋酸盐(NaAc,KAc或NH4AC)。
4.高感受效率感受态细胞的制备
—E.coliJM109或其它菌种
—LB液体培育基
—50mL离心管
—LB固体培育基
—LB平板
—SOB培育基(1L);
蛋白胨20g,酵母抽提物5g,NaCl0.58g,KCl0.38g,100×
镁离子母液(每100mL含MgCl2·
6H2O20.33g,MgSO4·
7H2O24.65g)10mL。
用1mol/LNaOH调pH至。
—SOC培育基:
SOB+20mmol葡萄糖(每100mLSOB培育基中加入50%的葡萄糖溶液720μL。
)
gCaCl2·
2H2O溶于100mLddH2O中。
用μm的微孔滤膜过滤除菌。
—1mol/LKCl:
gKCl溶于100mLddH2O中,高压灭菌。
—mol/LMnCl2;
gMnCl2·
4H2O溶于100mLddH2O中,高压灭菌。
—mol/L(K-MES):
g2(-N-吗啡啉)乙磺酸溶于约80mLddH2O中,用KOH调pH为,加水定容至100mL,用μm的微孔滤膜过滤除菌。
分装后于-20oC保留。
—二甲基亚砜(DMSO)。
—TB缓冲液:
10mmol/LK-MES(pH(mol/LK-MES(pH2mL),45mmol/LMnCl2mol/LMnCl210mL,15mmol/LCaCl2mol/LCaCl23mL),250mmol/LKCl(1mol/LKCl25mL),ddH2O60mL。
(用上述已经灭菌的母液配制,容量瓶事前也应灭菌。
—超净工作台,电热恒温水浴,分光光度计,离心机。
1.接种一环JM109于2mLSOB培育基中,37℃培育留宿;
或者将低温下保留的解冻后,于LB平板上划线。
2.取mL留宿培育物或挑一个单菌落于50mLSOB中,于18℃摇床中培育16-24h至OD600值达到。
3.掏出摇瓶置于冰浴中10min,转入50mL离心管中,4000rpm离心10min,弃上清液,将菌体悬浮于16mL预冷的TB缓冲液中,再置于冰浴中10min后离心搜集菌体。
4.将菌体从头悬浮于4mLTB缓冲液中,加入280µ
LDMSO使其终浓度为7%,并轻轻摇匀,冰浴至少10min,将感受态细胞分装入EP管中并置于液氮中冷冻5min以上(现在的感受态细胞可于液氮中保留40天以上而不影响转化频率)。
5.掏出EP管让其在冰浴上自然解冻,取200µ
L解冻的感受态细胞与1-10µ
LDNA混合,冰浴30min后,于42℃热冲击60s,当即置于冰浴中,5min后进行下一步。
注意:
从液氮中掏出的EP管应迅速打开盖子,不然EP管可能爆裂伤人!
6.向热冲击后的EP管中加入mL的SOC培育基,使整体积为1mL,37℃温和震荡(200rpm左右)培育1h;
7.将苏醒的培育物倒入一Ep管中,4℃,4000rpm离心10min,将培育基倒掉,用残留的培育基悬浮,然后用加样枪将菌液加到LB平板上,用推棒涂布直至培育基表面无可见的液体,将有培育基的一面向下培育约30min后,倒置培育留宿。
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- 感受态 细胞 制备 质粒 DNA 转化 提取