PCR检验技术.ppt
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PCR(PolymeraseChainReaction)检验技术黑龙江中医药大学临床医学院诊断教研室黄萍第一节概述一.何为PCR?
PCR聚合酶链反应英文全称polymerasechainreaction简称为PCR第一节概述二PCR的基本原理PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定DNA片断在体外扩增技术。
简单的说:
DNA的特性三步曲:
高温变性低温退火中温延伸通过一个热循环仪(DNA扩增仪)将特异片断的基因(DNA.又叫模板DNA)在短时间内,经过引物Taq酶和三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)等作用后,放大到几百万倍。
最后得到能肉眼看到的DNA区带或可定量分析的DNA量。
第一节概述三三简单复习一下简单复习一下DNA的结构与复制的结构与复制生命是由蛋白质合成的蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的氨基酸则是由无数个基因即DNA组成的这就是说这就是说DNA是蛋白质的生命是蛋白质的生命第一节概述DNA的基本构成单位:
脱氧核糖核苷酸磷酸核苷酸有4种碱基:
A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶第一节概述DNA的基本构成单位:
C-胞嘧啶(G)A-腺嘌呤(T)T-胸腺嘧啶(A)G-鸟嘌呤(C)脱氧核糖磷酸氢键第一节概述DNA的基本构成单位:
在DNA结构中,4种碱基,以AT、GC进行严格配对的。
AT、GC排列顺序的变化是无穷无尽的。
人体中大约有30亿(3X109)DNA的基因组。
碱基的顺序是DNA的生命。
第一节概述RNA与DNA的区别:
RNA的核糖是不脱氧的五碳糖RNA的4种碱基是A.U.G.CA腺嘌呤U尿嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶U在DNA中对应的碱基是T(胸腺嘧啶)第一节概述RNA与DNA的区别:
核糖脱氧核糖第一节概述碱基以3个为1组(三联密码)DNAATGAAGAGTGTCCATCACTAAmRNAAUGAAGAGUGUCCAUCACUAA蛋白质甲硫氨酸赖氨酸丝氨酸缬氨酸组氨酸组氨酸无意义ATG(AUG):
起始密码,是转译的开始TAA(UAA):
终止密码,是使1条肽链的合成到此中止。
CAT(CAC)简并密码,是一种氨基酸,可以有多于CAU(CAC)1个的三联密码,但也是特定的。
第一节概述DNA与蛋白质合成的关系用Watson和Crick的中心法则说明则是:
转录翻译DNAmRNA蛋白质逆转录第一节概述DNA与蛋白质合成的关系先由在细胞核中的DNA(基因)的碱基以3个为一组(三联密码)转录成mRNA的三联密码mRNA来到细胞核外的核糖体(蛋白质合成的场所)上,且每一种三联密码指使一种特定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来,变成了一种肽链(蛋白质)。
这个过程称为转译。
如果合成的肽链很长的话,也可以形成立体结构的蛋白质。
第一节概述DNA的结构:
DNA大分子以反向互补的两条单链形成双螺旋的立体结构。
其形状多少有点象人们常见的小食品“麻花”。
第一节概述DNA的复制半保留复制DNA的复制过程先是两个链分开,然后两条亲代链均以各自为模板,复制另一条互补链,之后再形成子1代的双螺旋结构,继之再以同样的方式复制成子2代、子3代、子4代。
此时把这种复制方式称为半保留复制。
第一节概述基因突变:
基因突变,也就是碱基的突变。
例如。
ATG编码是甲硫氨酸,但如果发生了基因突变,是ATG中的T变成了A,则三联密码变成了AAG,在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨酸对应的位置上就只能是赖氨酸,而不再是甲硫氨酸了。
这就是突变的本质。
有时人体就因此发生病变。
这也就是“突变”的主要实质。
第一节概述四扩增HBVC基因片断为例简述PCR原理HBV病毒是带有3182个碱基的双螺旋的双链DNA步骤1前处理2基因扩增3电泳4检测报告第一节概述基因扩增基因扩增模板DNAHBV病毒950C变性:
使双链打开,变成两个单链,二个单链是实验成败的关键550C退火:
在合成原料dNTPs.Mg2+的作用下,模板DNA与引物C构成二条杂交链,二条杂交链决定其实验的特异性720C延伸:
在Taq酶的作用下,以引物为起点,开始DNA链延伸反应,使链延长。
形成一条新的链对实验的特异性和产量有关!
生成二个特异性的DNA片断,完成了第一次循环生成的二个特异性的DNA片断,继续进行下一次循环,经过25-30次循环,模板DNA得到了大量的复制。
HBV-C可扩增到几百万倍。
第一节概述理论上讲,DNA的产量是指数方式增加,即n次循环后,扩增产物拷贝数为r=2n但是应该指出,扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。
在PCR反应后期,由于引物和底物的消耗,Taq酶活力下降等因素的影响,扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。
所以实际上进行30个循环后,扩增倍数一般可达106-107。
如果想提高扩增产物的产量,可将产物DNA样品稀释1000-10000倍后,作为新的模板再进行第二轮PCR扩增。
第一节概述PCR循环-Step1-热变性第一节概述PCR循环-Step2-引物对(PrimerPair)退火结合到靶序列第一节概述PCR循环-Step3-TaqDNA聚合酶催化引物延伸第一节概述第一个PCR循环结束-产生靶序列的两个拷贝(Copies)第一节概述靶序列扩增第一节概述上述的扩增是在PCR扩增仪上进行的。
然后将扩增产物经过EB电泳,最后在紫外透射仪上进行鉴定、定量分析。
第一节概述第一节概述报告方式定性:
PCRHBV-DNA+PCRHBV-DNA-定量:
PCRHBV-DNA1.00X103copies/mlPCRHBV-DNA1.00X103copies/ml第一节概述第一节概述第一节概述五PCR技术的特点
(一)特异性高1.以探测基因为目标。
属于“病因诊断”,针对性强。
对多种传染病,根据PCR检测结果可以确诊。
2.在感染性疾病的基因诊断中,不仅可以检出正在生长的病原体,也可检出潜伏期的病原体。
既可确定既往感染,也可确定现行感染。
尤其对那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体(梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等)采用PCR检查来确定感染就特别有效。
PCR检测的靶样品是病原体的核酸,与生物化学和免疫学检查相比,PCR结果与病原体分离培养结果更为一致,直接反应病原体的存在与否。
第一节概述
(二)灵敏度高在PCR扩增中,模板DNA以指数级迅速增加,样品中极其微量的靶序列在数小时内即可增加上百万倍,因此检测灵敏度高。
ELISA(酶联免疫吸附试验)灵敏度高ngRIA(放射免疫分析)灵敏度高pgPCR(聚合酶链反应)灵敏度高fg理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。
可利用单一双倍体细胞。
一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。
从而提高临床诊断的阳性率和准确率。
第一节概述(三)简便快捷有了扩增仪,有了商品化试剂盒,操作者不必自配各种试剂,只需将样品作简单处理和加样后,仪器即可自动循环进行扩增。
许多PCR检查现在在数小时左右即可出报告。
第一节概述(四)对样品要求低几乎所有的临床标本都可用于PCR扩增。
甚至低温保存多年的陈旧标本。
PCR检测病原微生物,并不要求标本中有存活的病原体。
病原体虽然失活,只需有完整的靶序列核酸,PCR就可以检出来。
一些过去靠脑脊液,脊髓检查的项目PCR以其高灵敏度和高特异性,从检查血、唾液或尿标本同样可以得到一致的结果,为标本采集带来方便,也使检测范围扩大和容易展开。
第一节概述(五)PCR的局限性由于Tag酶缺乏3-5端的外切酶活性,因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入,使PCR扩增产物有一定程度的错误掺入。
但是错误掺入的碱基有终止链延伸作用的倾向,这使得发生了的错误不会进一步扩大。
PCR由于高敏感性容易导致交叉扩增。
在实验室污染的情况下可能出现假阳性结果。
第一节概述(五)PCR的局限性在引物针对范围过窄或存在抑制剂等影响下也可出现假阴性结果。
PCR有优点也存在缺点。
它是现有各种检验方法的一种补充而不是替代。
尤其对一些生物化学、免疫学检验可以获得明确结果的情况下,就没有必要滥用PCR。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断
(一)病毒的检测1PCR检测人类巨细胞病毒(PCRHCMVDNA)标本采集:
尿液、血液、口咽部标本、脑脊液、羊水、组织标本、石蜡切片等。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断1(PCRHCMVDNA)临床意义:
HCMV属疱疹病毒科,是一种DNA病毒。
本病的特征性病变是受感染细胞体积增大,胞核和胞浆内出现包涵体。
此种病变细胞可见全身组织、器官,引起相应症状。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断1(PCRHCMVDNA)临床意义:
HCMV感染后轻者:
呈亚临床不显性感染,即隐性感染重者:
在免疫功能低下者呈弥漫性病变,严重者甚至死亡。
多见于器官移植而接受免疫抑制剂治疗。
恶性肿瘤接受化疗后极易受HCMV的感染。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断孕期妇女由于内分泌及免疫状态的改变,约有7.7-10.2%的孕妇发生原发或继发感染。
病毒通过胎盘,引起胎儿的先天性感染。
可致流产、早产、死产。
一般急性感染指标阳性的孕妇,若胎儿情况不佳,如胎心异常。
胎儿腹水等,应立即终止孕娠。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断受HCMV感染的早产儿可出现全身感染综合症,即称为巨细胞包涵体病(CID),体征为全身皮肤剥脱,点状出血,肝脾肿大,黄疸,血小板减少,小头畸形,视力、听力障碍等。
因此HCMV是引起人类先天畸形的重要原因之一,对社会的危害性很大。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断2PCR检测风疹病毒(PCRRVRNA)标本采集:
血液、(血浆、血清)羊水、第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断2PCR检测风疹病毒(PCRRVRNA)临床意义:
风疹病毒属于披膜病毒科,风疹病毒属,是RNA病毒。
风疹又曾为德国麻疹,但较麻疹症状轻,合并症少。
受风疹病毒感染的成人,其症状类似一般感冒,其不同点是患者颜面、躯干、四肢发生类似麻疹样的红斑丘疹。
多在1-3天消退,预后良好。
儿童少年期感染风疹症状比成人轻,甚至不显症状。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断2PCR检测风疹病毒(PCRRVRNA)临床意义:
孕妇受风疹病毒感染后,可经血液通过胎盘侵犯胎儿,引起流产、死产。
一般孕妇在四个月以前处于风疹病毒急性感染期,应立即终止妊娠。
受风疹病毒感染的活产者大约有20%胎儿表现先天性风疹综合症。
其表现:
a.体重低于2500g且发育迟缓的低体重儿。
b.出生后全身器官受损,导致畸形,视力、听力障碍,心血管系统异常等。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断3PCR检测单纯疱疹病毒(PCRHSVDNA)标本采集:
疱疹液、溃疡底部的刮取物、唾液、结膜液、角膜刮取物、阴道棉拭子(宫颈分泌物)、脑脊液、脑活检标本等。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断3PCR检测单纯疱疹病(PCRHSVDNA)临床意义:
单纯疱疹病毒(HSV)为一种双链DNA病毒,有两个血清型HSV-I主要侵犯腰部以上的部位,主要侵犯口、唇的皮肤黏膜,引起眼、面部的感染HSV-II主要侵犯腰部以下的部位一般与外生殖系统感染和新生儿感染有关。
如:
引起生殖器疱疹男性:
阴茎、包头、龟头的损害女性:
子宫颈的病变近年来I、II型合并感染为多见第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断3PCR检测单纯疱疹病(PCRHSVDNA)临床意义:
孕妇感染HSV-II后可经胎盘或生殖道上行感染引起胎儿宫内感染。
其后果与HCMV、RV、TOX的先天感染相似。
(自然流产、早产、死产)一般孕妇若HSV-II急性感染指标阳性者应终止妊娠。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断3PCR检测单纯疱疹病(PCRHSVDNA)临床意义:
受HSV感染的婴儿,可为小头、脑钙化、小眼球患儿。
或出生后4-5天发生发热、痉挛、呼吸困难、出血倾向,以致死亡。
病死率高达90%。
第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断4PCR检测人乳头瘤病毒(PCRHPVDNA)标本采集:
宫颈分泌物(患者发病处的活组织及分泌物)第二节PCR检验技术的临床应用感染性疾病的确定诊断4P
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