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目录
摘要……………………………………………………………………………………1
关键词…………………………………………………………………………………1
Abstract………………………………………………………………………………1
Keywords……………………………………………………………………………1
引言……………………………………………………………………………………1
1材料与方法…………………………………………………………………………1
1.1材料………………………………………………………………………………1
1.1.1仪器……………………………………………………………………………1
1.1.2试剂……………………………………………………………………………2
1.1.3溶液的配制……………………………………………………………………2
1.1.4菌种……………………………………………………………………………2
1.2实验方法………………………………………………………………………2
1.2.1粗酶液的硫酸铵盐析…………………………………………………………2
1.2.2SephadexG-150分子筛层析…………………………………………………3
1.2.3木聚糖酶的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………3
1.2.4木糖标准曲线的测定…………………………………………………………4
1.2.5木聚糖酶活力的测定…………………………………………………………4
1.2.6蛋白含量的测定………………………………………………………………4
2结果与分析…………………………………………………………………………5
2.1木糖标准曲线……………………………………………………………………5
2.2蛋白含量标准曲线………………………………………………………………6
2.3粗毛栓菌木聚糖酶柱层析实验结果……………………………………………6
2.4活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后显结果…………………………………………7
3结论…………………………………………………………………………………8
参考文献………………………………………………………………………………9
致谢……………………………………………………………………………………9
表1-1木糖浓度与光密度值的关系…………………………………………………5
图1.1木糖标准曲线图…………………………………………………………5
表1-2牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系………………………………………6
图1.2蛋白含量标准曲线…………………………………………………………6
表1-3粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果………………………………………6
图1.3SephadexG-150柱层析图谱…………………………………………………7
图1.4活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的显色图……………………………………7
粗毛栓菌木聚糖酶的分离和纯化
生物工程专业学生XXX
指导教师XXX
摘要将粗毛栓菌木聚糖酶粗酶液经SephadexG-150分子筛层析柱,最后通过活性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步分离纯化,获得具有木聚糖酶活性的组分。
关键词粗毛栓菌,木聚糖酶,分子筛层析,活性聚丙烯酰胺凝胶电泳
IsolationandpurificationofxylanaseinTrametesgallica
AbstractThecrudeenzymefromwheatstrawcultureofTrametesgallicaFr.wasappliedtoSephadexG-150gelfiltration.Acomponentwithxylanaseactivitywasfinallyobtainedbynativepolyacrylamidegel
electrophoresis.
KeywordsTrametesgallicaFr.,xylanase,SephadexG-150gelfiltration,nativePAGE
引言
木聚糖是植物细胞壁中主要的半纤维素成分,是自然界中仅次于纤维素的可再生的丰富生物资源[12]。
木聚糖降解需要木聚糖酶系的协同作用,主要包括作用于主链内部木糖苷键的β-l,4-内切木聚糖酶(endo-l,4-β-D—xylanxylanohydrolase,EC.3.2.1.8),将木聚糖分解成木寡糖和少量的木糖;
作用于木聚糖和低聚木糖非还原端的β-1,4.外切木聚糖酶(exo-l,4一β—D—xylanxylanohydmlase,EC.3.2.1.7),产物为木糖;
作用于低聚木糖非末端β-木糖苷酶(1,4一β-D-xylosidase,EC.3.2.1.37),释放出木糖[2]。
木聚糖酶在自然界广泛分布,海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。
由于微生物来源的木聚糖降解酶普遍存在于自然界且种类繁多应用领域广泛[1]。
近年来,木聚糖酶在饲料、造纸及食品等行业均有广泛的应用,如纸浆生物漂白,功能性低聚木糖生产及面团改良剂,饲料添加剂等[13]。
本文主要对粗毛栓菌木聚糖酶进行了分离纯化以便对其酶学性质进行进一步的研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器
仪器名称
生产厂家
Hisense冰箱
海信北京电器有限公司
TH-500梯度混合器
上海沪西分析仪器厂
HL-2恒流泵
XWT-S小型台式记录仪
上海自动化仪表三厂
HD-核酸蛋白检测仪
上海泸西分析仪器厂
BJQ-74-2自动部分收集器
上海医用分析仪器厂
TU-1810紫外可见分光光度计
北京普析通用仪器有限责任公司
恒温水浴锅
北京长安科学仪器厂
1.1.2试剂
SephadexG-150购自Pharmacia公司;
桦木木聚糖(birchwoodxylan)购自美国Sigma公司,其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3溶液的配制
1.1.3.13,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
甲液:
准确称取10gNaOH,用去离子水溶解,定容至200mL,将其分为50mL和150mL两部分,在50mLNaOH溶液中加入2g苯酚,在150mLNaOH溶液中加入10gDNS,加热溶解;
乙液:
称取300g酒石酸钾钠溶于500mL水中,加热溶解。
待甲乙两种溶液冷却后,将二者合并、混匀,加入0.5g亚硫酸氢钠,搅拌、混匀,定容至1000mL。
1.1.3.20.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液(pH5.0)
将700mL的0.2mol/L醋酸钠溶液和300mL的0.2mol/L的醋酸溶液混合,用pH计调至pH5.0。
1.1.3.31%桦木木聚糖溶液
称取0.5g桦木木聚糖,加入30mLpH5.0的醋酸钠-醋酸缓冲液,加热、搅拌溶解,冷却后用同样的缓冲液定容至50mL,4℃冰箱保存。
1.1.3.4考马斯亮试剂
称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%的乙醇中,加入10mL85%的磷酸,用去离子水稀释到1000mL。
1.1.4菌种
本实验室保存的现成的具有较强降解木质纤维素能力的菌株-粗毛栓菌(TrametesgallicaFr.),白腐担子菌粗毛栓菌系的XXX博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上,从被砍伐的杨树上分离得到的。
该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定,定名为Trametesgallica[4]。
1.2试验方法
1.2.1粗酶液的硫酸铵盐析
向粗酶液中添加固体(NH4)2SO4至30%饱和度,4℃过夜,离心(6,000r/min,4℃)15min,除去杂蛋白沉淀物;
然后将上清液的硫酸铵饱和度上调至75%,再于4℃静置过夜,离心(7,500r/min,4℃)10min,弃上清,得沉淀约100mL,将沉淀于-20℃冰箱中保存,备用。
将沉淀透析(截留量12-14KD),每隔3-4小时换一次4℃去离子水,直到透析袋内酶液无残留的(NH4)2SO4。
透析液经聚乙二醇(平均分子量>20,000)浓缩后,作为下一步进行分子筛层析的样品。
1.2.2SephadexG-150分子筛层析(1.6cmx115cm)
将处理好的凝胶放在大烧杯中,用去离子水反复冲洗至中性,再用50mmol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.0)冲洗几次。
将凝胶装制成1.6×
115cm柱,上样前用上述缓冲液平衡柱,过夜。
上样时样品体积不宜过多,约为柱体积的1%-5%。
洗脱线速度为6cm/h,每管收集2mL。
检测流出液的酶活性,合并具有相同酶活性的组分,然后再如上法进行(NH4)2SO4盐析、离心和透析等步骤[7]。
1.2.3木聚糖酶的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳
活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)[5,11]用于木聚糖酶的回收制备及活性检测,样品为经过层析法分离的部分纯化的酶样品。
8%分离胶的制备(20mL):
取5.3mL30%凝胶储备液(含29%丙烯酰胺和1%N,N’-亚甲双丙烯酰胺)、2.5mL3.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.9)、0.1mL10%TEMED、0.2mL10%过硫酸铵、11.9mLdH2O,混匀,灌入DYY-Ⅲ5型垂直板电泳槽的玻璃板间隙中,使液胶的高度为玻璃板纵长的2/3-3/4。
上面封一薄水层。
使玻璃板在30℃恒温箱中聚合20-30min。
5%浓缩胶的制备(10mL):
取1.7mL30%凝胶储备液、2.5mL0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.7)、0.05mL10%TEMED、0.1mL10%过硫酸铵、5.65mLdH2O,混匀,加于分离胶上面的空隙中。
在浓缩胶的上面留有1-2cm高的空隙(上样用),再如上法进行恒温聚合。
进行制备电泳时,将酶液与6×
加样缓冲液(含pH6.7的0.75mol/LTris-HCl、30%甘油、0.01%溴酚蓝)混合,上样后,利用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲系统(25mmoL/LTris、250mmol/L甘氨酸),于4℃进行恒流(10mA)电泳,待样品进入分离胶后,再将电流升至15mA,继续电泳。
电泳至溴酚蓝指示剂离胶底面1-2cm时停止电泳。
取出并分离玻璃板,并使凝胶附着在一块玻璃板上。
用刀片纵向切去凝胶两边的部分(每边约1cm宽)。
由于酶样品在凝胶的两边沿处往往略呈弓形,不宜用来进行酶的定位,故将凝胶的两边部分切除。
再用刀片沿凝胶一侧纵向切去宽约1cm的胶条,将此胶条的分离胶部分从上到下切成2mm长的胶块,放在相应编号的EP管中,捣碎胶块,然后向每个EP管中分别加入50µ
L的1%桦木木聚糖,置于45℃水浴锅中保温1.5h,再向每个EP管中分别滴加100µ
L1%DNS,沸水浴煮15min。
观察各管中颜色变化。
进行显色反应期间,用保鲜膜覆盖剩余胶块,并置于4℃冰箱中暂时保存。
1.2.4木糖标准曲线的测定
准确称取干燥至恒重的木糖标准品50mg,用蒸馏水溶解,定容至50mL。
按下表在各管中加入各种试剂:
数量管号
项目
空白
1
2
3
4
5
含糖总量(mg)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
木糖溶液(mL)
蒸馏水(mL)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
DNS试剂(mL)
1.5
将上述试剂加完后,混匀各管,沸水浴5min,冷却至室温,分别用去离子水将各管定容至25mL,混匀。
选用光程1cm的比色杯在550nm处比色,用空白管作对照,测各管光密度值,每管重复三次,求平均值。
以木糖浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线[4]。
1.2.5木聚糖酶活力的测定
采用DNS(dinitrosalicylicacid)法即3,5–二硝基水杨酸法[8,10]。
取0.9mL由50mmol/LNaAc-HAc(pH4.5)缓冲液配制的1%桦木木聚糖于25mL刻度试管中,加入0.1mL适当稀释的酶液,于45℃水浴中保温30min后,加入3mL1%DNS试剂,混匀,在沸水浴中煮15min,冷却至室温,补加水至25mL,混匀,于550nm处测定吸光值。
以每分钟催化木聚糖水解生成1μmol木糖所需的酶量定为1个活力单位。
木聚糖酶酶活力计算公式如下:
木聚糖酶酶活力(Umin-1mL-1)=nA/(150.13×
30)
其中,n为酶液稀释倍数,A为标准曲线上吸光值所对应的木糖微克数,150.13为木糖分子量,30为酶作用时间(min)。
1.2.6蛋白含量的测定
参照Bradford[9]法:
取一系列试管,按下表分别加入下列试剂:
目
项
量
数
号
管
BSA(100ug/mL)
考马斯亮蓝G-250(mL)
0.0
将上述试剂加完后,混匀,室温静置2min,选用光程为1cm的比色杯,以不加牛血清白蛋白(BSA)的试管为对照,在595nm处比色。
以牛血清白蛋白的浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。
取待测样品溶液1mL,加入考马斯亮蓝G-2505mL,混匀,按上述方法测定595nm的光密度值。
平行做3份。
比色后,从标准曲线上查出待测样品的蛋白质浓度。
2结果与分析
2.1木糖标准曲线
在上述条件下,得木糖标准品浓度与光密度值的关系(表1-1)。
表1-1木糖浓度与光密度值的关系
木糖标准品(mg/mL)
0.2
光密度值(OD550)
0.101
0.280
0.464
0.622
0.747
以木糖含量为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制出标准曲线(图1.1)。
计算出标准曲线方程为:
A=0.815x-0.047(R2=0.994)结果表明,在0-0.8mg/mL范围内木糖浓度与光密度值线性关系良好。
图3-1木糖标准曲线图
2.2蛋白含量标准曲线
在上述条件下,得牛血清蛋白浓度与光密度值的关系(表1-2)
牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系
BSA浓度(⎧g/mL)
20
40
60
80
100
光密度值(OD595)
0.236
0.469
0.676
0.788
0.906
以牛血清白蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标绘制出标准曲线(图1.2)。
得到标准曲线的回归方程为:
A=0.00825x+0.117(R2=0.971),结果表明,牛血清白蛋白量在0.2-1mg/mL范围内与光密度值线性关系良好(图1.2)。
图1.4蛋白含量标准曲线
2.3粗毛栓菌木聚糖酶柱层析实验结果
木聚糖酶粗酶液经过盐析离心,分子筛层析等纯化步骤结果见表1-3。
表1-3粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果
Table1-3SummaryofthepurificationofxylanaseinTrametesgallica
纯化步骤总酶活/(U)总蛋白/(mg)比酶活(U/mg)回收率%纯化倍数
purificationTotalTotalSpecificRecoveryPurification
stepactivityproteinactivityratefold
硫酸铵沉淀4.54×
1051.00×
10445.41001
(NH4)2SO4fractionation
分子筛层析2.86×
1042.25×
102127.116.32.81
SephadexG-150molecularsieving
硫酸铵沉淀2.48×
1033.596689.660.0515.19
SephadexG-150分子筛层析洗脱曲线见图1.3。
图1.3SephadexG-150柱层析图谱
Fig.1.3ElutioncurveoftheSephadexG-150chromatography
2.4活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后显色结果
按照1.1.4中所述方法得到的结果如图1.4所示:
图1.4活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的显色图
从显色结果上可以看出,1号到6号的EP管的颜色比其它各管的颜色深,即分离胶上从负极到正极第2-12mm的位置上有酶存在;
而第20到第28管的颜色也比其他它的各管的颜色深,可能是溴酚蓝指示剂的干扰。
3讨论
本试验从粗毛栓菌的木聚糖酶粗酶液中,经过盐析,离心和分子筛层析等操作后,结果得到一种木聚糖酶的混合组分,木聚糖酶粗酶液得到初步分离和纯化。
首先经过硫酸铵盐析得到的组分经SephadexG-150分子筛层析,此阶段酶的纯化倍数是2.81,回收率是6.3%;
再经过盐析后,酶的纯化倍数和回收率分别是15.19和0.05%。
得到的组分通过活性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于进一步的分离纯化和回收。
经SephadexG-150分子筛层析后得到的酶液纯化倍数得到很大的提高,但回收率很低,酶的损失很大,并且纯度和比活力均低于范美霞[14]的相应结果,其原因可能是上样量较大,造成样品分布过广且未充分回收。
另外,分离纯化步骤过于单一,使该实验未能达到理想的纯化效果。
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[14]范美霞.2006.粗毛栓菌木聚糖酶的分离纯化及性质研究.四川师范大学硕士论文,24-24.
致谢
毕业论文设计即将完成,首先诚挚的感谢我的指导老师XXX教授。
孙老师曾从事粗毛栓菌的木质纤维素降解酶及其基因克隆的研究。
正是由于此,我才有机会接触这个课题。
孙教授学识广博,治学严谨,态度认真,要求严格,在毕业论文的实验过程中,孙老师给了我细心的指导和教育,谢谢您!
同样也要感谢实验室里的其他同学,在试验期间他们给了我很大的帮助。
谢谢你们!
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