遗传育种学实验指导Word下载.docx
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(10)离开实验室前,将所用过的仪器用具擦洗干净,并放回原处;
关闭电源、水源,并指派人员打扫清洁。
二、显微镜的清洁与保养
显微镜是遗传育种学实验中最重要的工具,必须注意防尘、防湿、防高温、防药品侵蚀。
(1)提取镜箱时,必须右手提着镜箱,左手托着箱底,镜箱门朝着胸前一面;
取显微镜时,必须右手紧握镜臂,左手托着镜底,防止显微镜滑落损坏。
(2)显微镜取出后,先用软毛刷、纱布拂擦镜身的灰尘污物,各处缝隙及镜头上的灰尘,纤维等用洗耳球吹去,然后用擦镜纸试擦物镜和目镜头。
擦时只能顺着一个方向多次抹擦,不能旋转抹擦,最后用细白绸把镜头再擦一次。
(3)镜检时,低倍物镜只能作粗调旋调焦距,转换高倍物镜时,只能用细调螺旋焦距,切勿损坏镜头。
(4)如果发现镜头被药物或者脏物沾污,应立即用擦镜纸浸沾少许二甲苯(以刚湿润擦镜纸为度)擦掉脏物或药液,并随即用擦镜纸擦干。
(5)使用完毕后,同
(2)进行清洁工作;
转动物镜不要对着聚光镜,并降至最低点,放回镜箱,归还原处。
(6)镜箱内干燥硅胶,必须定期更换。
(7)显微镜必须与化学药物分开放置,严禁混藏。
三、玻璃器皿的清洁
1、器皿的清洁
(1)将玻璃器皿放在搪瓷盆内加入适量的洗衣粉煮沸80分钟;
(2)冷却后用清水洗干净,滤干水分;
(3)放在洗涤液中泡30分钟;
(4)再用清水冲洗干净,蒸馏水荡涤一下,晾干。
2、新载玻片与盖玻片的清洁
将新载玻片与盖彼片分别放在盐酸酒精中(95%酒精100份+浓盐酸2份)浸泡4小时,再用流水冲洗干净,蒸馏水荡涤一下,滤干水分,放入95%酒精中备用。
3、陈旧载玻片与盖玻片的清洁
用过的陈旧载片与盖片、不适用的石蜡切片,清洁方法如下:
(1)将以上各种玻片放在洗衣粉水中煮15分钟。
(2)在热水中洗去残留的树胶和脏物,把载片和盖片分开,按下列步骤分别清洗。
(3)清水冲洗。
(4)洗涤液中浸泡30分钟。
(5)清水冲洗,蒸馏水荡涤一下。
(6)95%酒精浸泡备用。
擦试盖片时要小心,一只手夹住盖片两个边缘,另一只手持清洁纱布同时擦试两面,两指着力要均匀一致。
实验一有丝分裂(复习内容)
一、实验目的
了解有丝分裂过程中染色体的形态变化。
二、原理
植物根尖是细胞分裂的旺盛区,其细胞核内的染色体在8-羟基喹啉(或
对二氯苯)作用下,刺激染色体收缩、变粗,且避免染色体在细胞中凝聚一团,再经过盐酸等物质处理,使细胞之间的壁溶解,固定杀死细胞,染色体经碱性染料染色后,即可制做永久片,观察有丝分裂各期的形象。
有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式,有丝分裂期间,细胞核内每一染色体均进行自我复制,分裂期间,染色体变化不同可分成紧密衔接的四个时期。
前期:
细胞核中出现染色体,细长缠绕成团,随后逐渐粗短。
每条染色体是由两条共着丝点的染色单体组成,随着核仁核膜的消失而进入中期。
中期:
染色体逐渐集中于细胞中部,成一排于赤道面上。
这时纺锤丝的一端连接染色体着丝点,另一端集中于细胞的极处构成纺锤体。
由于染色体收缩,而形成明显的一定数目和形态的物质,因此,这个时期是染色体计数和形态观察的最适期。
后期:
每条染色体上的两染色单体,随着丝点的分离而分离。
在纺锤丝牵引下,每条染色单体分向两极,成为独立的染色体,在两极方向上出现了数目与母细胞相同的染色体群。
末期:
染色体到达两极,染色体又伸长变细,恢复到间期的状态,核膜、核仁重新出现,随纺锤体解体,在细胞赤道板上形成细胞壁,成为两个细胞,完成有丝分裂过程。
有丝分裂是均等的分裂过程,染色体一分为二,均匀分配到每个子细胞中,其结果,母细胞与子细胞,子细胞之间,染色体数目和组成完全相同,由此推断,生物细胞遗传物质的正确传递,与染色体准确复制和均等分配有关,支配生物性状表现的物质,主要存在于细胞核中的染色体上。
三、仪器药品
显微镜24台酒精灯6盏沙布15×
15ml16块
12×
12ml12块
擦镜纸1本石棉网6个温度计6支
培养皿大6个火柴6盒标签纸大60张
小40张
解剖针32个烧杯500ml16个毛笔6个
载玻瓶200三角瓶(大)6镊子32
盖玻片200吸水纸(大)3张瓷盘6个
恒温箱1个漏斗2个小天平2台
刀片12滤纸1盒标本盒6个
量筒100ml6个剪刀1把针剂瓶40个
10ml6个
容量瓶50ml1个浆糊1瓶标色试剂瓶40个
500ml1个
液管1ml玻璃棒6个小吸管12个
曲回针32个玻璃6只
酸酸详细8-羟基喹啉(或对二氯苯)乙醇(100%95%)3瓶
(铁钒——醋酸——洋红)
灯用酒精3瓶卡诺试剂蒸馏水二甲苯INHCI
封蜡封胶洗衣粉
附:
1、醋酸洋红(及固定液)配方见压片技术部分
2、8-羟基喹啉(0.OO2M)
取0.29克8-羟基喹啉先溶于少量乙醇溶液中,待完全溶解后浴于100ml蒸馏水中。
3、对二氯苯饱和溶液
对二氯苯溶于水中,60℃水溶条件下4小时后,使保留少量末溶物为度即可。
四、材料:
西瓜或蚕豆,或洋葱根尖细胞。
五、实验步骤:
1、种子萌发:
使萌发势较好的西瓜种子,在25℃一30℃条件下发根。
一般事前要用碱洗去表面粘膜,以免发霉,温水浸种24小时,然后播于培养皿中,上下均用沙布垫着,每天自来水冲洗一次,水分以饱和沙布为度,3-4天后萌发。
2、预处理:
待根尖长到0.5-1.5cm长时,一般在上午8:
00-10:
00,用刀片切下根尖置于O.002M8-羟基喹啉中(或饱和对二氯苯溶液中),1-1.5小时保证16℃-20℃,否则失败,蒸馏水洗2-3次。
3、固定:
把预处理,水洗后的根尖换上卡诺试剂固定,(无水乙醇:
冰醋=3:
1),2-6小时,蒸馏水洗2-3次。
4、离析:
换上工INHCI在60℃水溶液中,离析5-6分钟,立即水洗2-3次,处理时间不能过长,也不宜过短。
过长影响染色,过短细胞则不易分离分散。
离析的目的是为了使细胞中间层被酸水解,使细胞易于分离,除上种方法外,还有其它几种:
(1)固定后放入等量的95%酒精和浓盐酸混合液中2-10分钟,时间长短因材料不同而异。
(2)固定后用浓HCL离析1-2分钟,但禾本科植物用此法,其它不行。
盐酸处理后,必须用50%酒精洗一、二次。
如果残留盐酸太多,则会影响染色体的染色,这是造成不易染色的原因之一。
5、染色
镊取根尖,取下1-2mm长的分裂区组织于载片上,用吸水纸吸去过多液体,滴上一滴醋酸洋红,3-4分钟后压片。
材料不能太多,否则堆积后压片效果不佳,观察困难。
染色时间可根据室温和具体制片效果而定,室温高,时间短些,室温低则相应长一些。
轻轻盖上盖玻片(用沙布擦,将周围擦干净),用左手大拇指压紧盖片左下角,用铅笔的橡皮头弹击压有材料的盖片部位,直到中部的材料分散成雾状为最好。
离析的成败,直接关系到压片的效果,离析不完全时,往往会使材料聚积不散。
此后用吸水纸吸去过多染液,于显微镜下观察。
有保存价值的片子可暂用封蜡封好,以作永久性制片保留来用。
最好能贴上标签,避免混淆,在标签上注明材料、分裂期、姓名、时间。
作业:
1、每人交有丝分裂封蜡片1-2张。
2、画有丝分裂中期和后期细胞图1-2个。
附近:
酶解法
一、原理
纤维素酶和果酸酶作用下,分解细胞壁,使细胞中染色体分散开来,利于观察。
二、方法步骤
(目前)
(……)
3、前低渗
移入O.075MKCI中,18-28℃处理20分钟,蒸馏水冲洗2-3次。
4、酶解去壁:
移入2.5%果胶酶与2.5%纤液素酶等量混合液中,调PH-5.5,18-28℃酶解,1小时,蒸馏水冲洗2-3次。
5、后低渗:
移入18-28℃蒸馏水中低渗处理20分钟。
6、火焰制片:
截取lmm根尖分生组织置干清净载玻片上,加一滴新鲜卡诺试剂,用锤柄充分捣碎后,再滴入少量固定液在酒精灯上火焰干燥,使细胞分散,平展。
7、染色
用吉姆撤磷酸缓冲液调整PH至6.8,配制10:
1(或9:
1)吉姆撒染液,根据不同植物分别染色15分钟,蒸馏水冲净。
8、封片:
经二甲苯浸泡1小时后,晾干,用达马胶封片。
9、镜检:
观察细胞有丝分裂中期,分散较好时给予保存。
此方法使用于中期染色体数目及形态的观察。
实验二减数分裂(复习内容)
一、实验目的:
1、了解植物花粉母细胞减数分裂时相关形态特征,掌握取材标准,固定、染色和制片方法。
2、了解分裂的全程及各个时期染色体的形态变化。
二、实验原理:
减数分裂是染色体数目减半的有丝分裂,也叫做成熟分裂。
生物体在整个发育过程中,生长发育到一定阶段进入性成熟。
先分化出大小孢子母细胞,进行减数分裂,然后产生雌雄配子或性细胞,雌雄配子结合(即受精)后,成为受精卵。
减数分裂包括连续两次的细胞分裂过程,每个母细胞共形成四个子细胞,在高等植物中减数分裂开始的细胞是花粉母细胞及胚囊母细胞,减数分裂的直接产物是小孢子和大孢子,由于染色体只是在第一次分裂前的同期复制过一次,而细胞却分裂了两次,结果每个子细胞中的染色体就比原来细胞减少一半。
这两次连续的分裂都可分为紧密衔接着的前期、中期、后期和末期。
第一次分裂的前期变化最为复杂,又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期。
前期I
细线期:
核内出现明亮空腔,染色体呈细长丝状,首尾难分,互相缠绕,靠近核的一边,部分细丝则向核的另一边发散,如花束状,在电子显微镜下可以看到染色体成双的状态。
偶线期:
此期开始时,同型(同源)染色体上相对应的位点都非常准确地靠在一起,好象“拉练”一样,同型染色体这种相互吸引和纵向靠拢称为联会。
这是减数分裂和有丝分裂中染色体行为的主要区别之一。
由一对同源染色体联会在一起的单位叫做二价体,每个二价体包含着4根染色单体,故称为四合体,其中来自同一染色体的两根染色单体,叫做姐妹染色体,来自不同成员的染色单体,互称为非姐妹染色体。
粗线期:
配对的染色体随着螺旋化的加强而逐渐缩短变粗,染色体的个体性也逐渐明显。
在这个时期姐妹染色体之间可能发生片段交换,四合体中的四个染色单体,某一相对位置同时发生断裂而后差错地“愈合”,彼此交换了片段,染色体交换是生物变异的重要来源之一。
双线期:
同型染色体的两个成员之间开始互相排斥而彼此分开,但发生过交换的部位仍粘连在一起,形成交叉结。
交叉结的数目多少不定,一般在1一3个之间,所以双线期联合起来的染色体好象“麻花”一样。
终变期:
配对染色体的两个成员之间彼此排斥分离,使交叉结逐渐向两端移动,这种现象称为交叉移端,随着移端过程的进行,交叉结数目减少,最后只在末端相连,这时染色体高度浓缩,各二价体向核的四周扩散,因此是染色体计数的良好时期。
终变期末,核仁、核膜逐渐消失,乃进入中期。
中期I:
核仁、核膜完全消失,所有的二价体都排列在赤道板上,每对同型染色体的两个着丝点分别向着相对的一极,这个时期如果从极处向赤道面上观察,染色体的数目是比较容易计数的。
后期I:
二价体的两个成员开始分开,在纺锤丝的作用下,分别向两极移动,使得两端子细胞中的染色体数目减少了一半,注意这时每根染色体包括两根染色单体,其着丝点尚未分开,此时每对同型染色体中的两个成员必然分离,而非同型染色体之间则以同等机会随机结合,进入不同子细胞中,这是后代变异的重要来源。
末期I:
分向两极的染色体又聚合起来,核仁、核膜开始形成,于是一个母细胞分成了两个细胞,叫做二分体。
间期:
每个子细胞中核膜、核仁完全形成,但染色体螺旋并不消失,这个时期很短促,紧接着进入下一次分裂。
前期II:
染色体又重新出现,可见到每一染色体的两个姐妹染色单体互相排斥。
而着丝点处仍相连,形成“X”状。
中期II:
染色体显著缩短变粗,排列在两个子细胞的赤道板上。
后期II:
每个染色体的着丝点分裂,每根姐妹染色单体各得一个着丝点,成为独立的染色体,借助于纺锤丝,分别移向两极。
末期II:
分向两极的染色体聚集起来,组成新核,在赤道面出现膜体,植物中形成细胞壁,于是由一个母细胞共分裂为四个子细胞,植物花粉母细胞减数分裂刚结束时,这四个细胞仍联合在一起,叫做四分体。
减数分裂中染色体的行为变化与植物的遗传变异密切相关,遗传学的三个基本原则的共同的细胞学基础就是减数分裂,因此,应熟悉减数分裂各时期的特点。
三、实验材料:
蚕豆、大葱、洋葱、苹果、葡萄、枣、玉米等。
四、试验用品:
1、显微镜、温箱、1/1000天平。
2、盖玻片、载玻片、培养皿、量筒、三角烧瓶、皮头玻璃棒、酒精灯、小瓶、滴瓶、石棉网。
3、无水酒精、冰醋酸、蒸馏水、洋红。
4、小镊子、解剖针、吸水纸。
五、试验方法:
1、配置药品:
(1)、卡诺液:
纯酒精3份,冰醋酸1份。
(2)、醋酸洋红:
取45毫升冰醋酸加入55毫升蒸馏水中,至于酒精灯上加热至沸,移去火源,徐徐加入2克洋红粉末。
再加热1-2分钟冷却后加入几滴2%铁明矾(硫酸铁铵),过滤后至于棕色瓶中备用。
2、取材固定:
取材的时间及大小必须十分恰当,才能获得更多的花粉母细胞分裂相,各类作物减数分裂时相关的形态特征表现不一,现列表简述,供参考。
附表:
各类作物花粉母细胞减数分裂时期的相关形态特征
作物名称相关形态特征
猕猴桃幼蕾横径4~5mm为宜。
蚕豆幼小花蕾长约3~4mm为宜。
豌豆同
大葱从总苞刚刚散开的上端花蕾
洋葱同
西瓜花蕾约长1mm左右。
杏花芽顶端微型小口7×
3mm
桃花芽顶部有裂口,裂缝线露白,大小在6×
3mm。
白梨花芽基部露绿或褐色,花蕾大小3×
2.5mm为宜。
苹果花芽定形后,露叶1-2片,花蕾大小7.5×
葡萄展叶4-5或4-8片,花蕾横径1.4-1.5mm。
枣花蕾横径1.5mm左右。
在花序的分枝上,以上中部小穗发育早,无柄小穗发育早。
在一天内减数分裂旺盛的时间,因作物不同,时间不一,西瓜在早晨4-5时,蚕豆、豌豆在8-10时,洋葱在3-11时,玉米7-8:
30,果树以6-11时为好。
按标准取来之材料,投入卡诺氏液中,固定1-2小时,用95%的酒精洗两次,转入70%酒精中保存。
3、染色制片
用镊子取出经过固定的大小合适的花苞,先置于吸水纸上,吸去保存液或固定液,移至载玻片上,剖出花药,滴一小滴染色液,(醋酸洋红、醋酸地衣红、或醋酸-铁矾-苏木精I或III)注意切勿多加,用弯头解剖针截断花粉,并轻轻挤压,使花粉母细胞从切口散出。
而后用镊子把所有药壁残渣检除干净,这很重要,否则材料不易分散压平,片面不清洁,有碍观察,而且制作固定片时会引起材料的大量脱落。
置镜下初步检查,如花粉母细胞正处于分裂期即加上盖片,在其四周稍加染色液,将载片在酒精灯焰上来回烘烤几次,注意勿使药液沸腾,接着压片,如果染色太浅,可在盖片四周稍加染色液,待其渗透,再烘、再压,直至染色体着色明显清晰为止。
4、镜检
观察时首先要识别几种细胞:
体细胞、花粉母细胞、四分体脱开后刚发育的幼小花粉粒以及成熟的花粉粒等。
一般在镜下可以看到一些形态较小而且整齐均一的细胞,那是花药壁体细胞,同时可看到一些形态显著较大,比前面那种细胞大上十倍、圆形或扁圆形,不很规则,其细胞核较大,那就是花粉母细胞,如有形状比体细胞大但比花粉母细胞小,略呈扇形的细胞,那就是从四分体脱开后的幼小的花粉,如有形状较大,椭圆形,似有明显的外壳,内部较透明的细胞,则是长大的花粉粒。
减数分裂是从花粉母细胞开始的,凡形状大小同花粉母细胞相近而核范围内似有空腔出现丝状、条状、棒状物者,即正在进行减分裂,注意对这类细胞进行观察检查。
六、作业
1、每人作出二张良好的监时片。
2、绘制减数分裂图二个(分裂期不限),并简述其特征。
实验三染色体核型分析
一、实验目的及意义
把生物核内全部染色体按其形态特征所进行的综合分析,称为染色体核型分
析。
染色体数目的多少和组成是生物性状稳定的前提,对生物染色体的核型分析,对于鉴定和确定染色体变异具有重要意义。
通过本实验,要求学生理解核型分析的原理及目的,掌握染色体核型分析的一般方法。
二、原理:
各种生物的染色体数目都是恒定的,而且它们在体细胞中常常是成对存在的
的。
可以根据同源染色体的形态特征如长度、臂比、着丝点的类型、随体的有无等进行配对、鉴别和命名,为研究染色体变异提供参考。
三、用品:
剪刀、尺子、胶水、染色体照片
四、材料和方法
1、材料:
黑麦2n=2x=14
2、方法:
(1)测定染色体的长度:
染色体长度可分为绝对长度和相对长度。
绝对长度是在显微镜下测量的长度(u)。
一般采用相对长度,相对长度(%)是指一条染色体的实测长度占整个染色体组的总长的百分率。
(2)臂比=长臂长度/短臂长度
(3)着丝点类型:
臂比为1.00时,为正中着丝点(T),臂比为1.01一1.70时,为中部着丝点(m),臂比为1.71一3.00时,为近中着丝点(sm),臂比为3.01一7.00时为近端着丝点(st),臂比为7.00以上时,为端部着丝点(t)。
(4)根据所测数据,对各对染色体进行配对,并剪下粘贴,给予序号命名。
五、作业
对黑麦的染色体进行核型分析。
暂编号
相对长度(%)
臂比
着丝点类型
备注
1′
2′
3′
4′
5′
6′
7′
8′
9′
10′
11′
12′
13′
14′
实验四分离规律
通过对杂种二代(F2)一对性状的分离现象的观察,加深对孟德尔分离规律的理解。
二、实验材料
1、玉米杂种F2分离果穗和固定的杂种Fl雄蕊。
2、番茄杂种F2分离植株。
三、实验用品
培养皿、镊子、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片、解剖刀、铅笔、橡皮、报告计载表、计算器、I2一KI溶液。
四、实验原理
分离规律指出,相对性状由相对的两个遗传因子控制,一个来自交方,另一个来自母方,两个遗传因子在体细胞内成对存在。
当杂种形成配子时,成对因子彼此分离,因此,每个配子内只含有相对因子的一个,配子数目相等,并且各种异性配子相互结合的机会均能等,从而使杂种植株在自交或测交的情况下,表现出一定的比例(3:
1或1:
1)。
现以玉米性状分离和配子分离来证实。
(一)玉米:
1、性状分离:
玉米中,紫色籽粒玉米和红色籽粒表现为一对基因的差别,以隐性红色籽粒玉米为母体,与纯合显性紫色籽粒玉米杂交,子代为紫色籽粒。
F1植株在减数分裂时,等位基因要发生分离,F1自交产生显隐性为3:
1的分离比例,F1与隐性亲本测交后,得到显隐性为1:
1的分离比例。
2、配子分离:
杂合非糯玉米在花粉粒上的分离,直接证明配子发生分离,也直接说明了相对基因的分离,纯合糯玉米(wxwx)产生的花粉粒含枝链淀粉,与碘作用呈红棕色,纯合非糯玉米{WxWx}产生的花粉粒含枝链淀粉,与碘作用呈红棕色,杂合非糯玉米(Wxwx)则产生上述两种数目相等的花粉粒,用碘染色后后,半数花粉粒呈兰黑色,半数花粉粒呈红棕色,由此证明,基因的分离是在形成配子的减数分裂过程中进行的。
如果F1植株上形成的花粉1:
1的,在其自交所形成的F2代果穗上将含有3/4种子为非糯,1/4种子为糯质。
F2F1花粉
F1卵细胞
Wx
wx
WxWx(非糯)
Wxwx
Wxwx(非糯)
wxwx(糯)
非糯:
糯=3:
1
用I2一KI对F2的种子逐粒染色可以看出结果,假如是3:
1,则说明F1的花粉定是1:
1。
(二)番茄
紫茎A对绿茎a为完全显性,那么AA×
aa的F1代自交后代应为3:
1比例。
1、每人数杂合紫玉米(Prpr)的自交和测交果穗各一穗,将统计数字填入
下表,进行适合性测定,检查是否符合一对基因自交3:
l的分离结果。
籽粒性状
显性
隐性
总数
观察数(o)
理论数(e)
偏差a=o-e
a2/e
X2=
适合性测定:
用卡方法(X2-test)测验实际分离比例是否与预期理论值相符。
卡方
e
(o-e)2
公式如下:
X2=∑自由度(d·
f)=2-1
查X2表,如P<
0.05表示不符合,即实际所得的结果,不符合某种分离比例;
如果P>
0.05
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