现代生物化学技术青岛大学Word格式文档下载.docx
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1.标准曲线的绘制:
取6支试管,按表1加入试剂,混合均匀后,放置3min后,在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质溶液(mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量(mL)
G-250试剂(mL)
蛋白质含量(μg)
20
40
60
80
100
摇匀,静置3min,在波长595nm处比色,读取光密度。
2.样品中蛋白质含量的测定:
准确称取鲜样2g,用2mL蒸馏水在冰浴中研成匀浆,转移到25ml容量瓶中并定容。
在8000r冻离心10min,取上清液待测。
另取一支试管,加入0.2mL样品提取液,加入0.8mL蒸馏水和5mLG-250溶液,充分混合,放置3min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。
(mg/g)
4.血清中蛋白质含量的测定:
取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中,加生理盐水至刻度,摇匀。
(此法样品稀释200倍)。
取试管二只,按下表操作:
摇匀,静置3min,在波长595nm处比色,读取光密度,查标准曲线,求得稀释样品蛋白质浓度未知样品蛋白质浓度μg/ml=稀释样品浓度×
稀释倍数
【注意事项】
1、如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色最稳定。
2、测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验二Lowry-酚试剂法测定蛋白质定量
【原理】
Lowry法是双缩脲法(Biuret)和斐林(Folin)–酚法的结合与发展,其原理是:
蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后,碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜–蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后,在碱性条件下,这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关,所以可以用于蛋白质含量的测定。
Lowry法除使肽链中络氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈,其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍,约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法适于微量蛋白的测定,对多个样品同时测定较为方便。
但对于不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2–CO–NH–CO–NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键,因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得,操作简便,可测定的范围为1~10mg蛋白质,适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定,能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如Tris缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀。
2.斐林(Folin)–酚法的原理该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应:
第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质–铜络合物;
第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
反应约在15min内有最大显色,并至少可稳定几小时。
此法也适用于测定酪氨酸、色氨酸含量。
此法的优点是操作简单,迅速;
灵敏度高。
其不足之处是此反应受多种因素干扰。
在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。
【试剂与仪器设备】
1、试剂
(1)碱性铜液:
试剂A:
2%Na2C03(用0.1mol/LNaOH配制)。
试剂B:
0.5%CuS04·
5H20(用1%酒石酸钠或酒石酸钾配制)。
碱性铜溶液:
用50份试剂A和1份试剂B混合配成。
混合后溶液一日内有效。
(2)酚试剂:
于1500ml园底烧瓶内,加入钨酸钠(Na2W042H2O)100g,钼酸钠(Na2M0042H20)25g,蒸馏水700ml,85%磷酸50ml及浓HCll00ml,用软木塞装置冷凝器上瓶上,慢慢加热,回流10小时,再加硫酸锂150g及水50ml后,必要时过滤。
如显绿色,可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色,然后煮沸除去过剩的溴,冷却后稀释到1000ml,此为贮存液,贮于暗处。
使用时等量水稀释之。
(3)标准蛋白液(250μg/mL):
称取牛血清蛋白25mg,加生理盐水溶解并定容至100mL。
(4)应用血清:
取血清0.1ml于50ml容量瓶中,加0.9%NaCl至刻度,混匀备用。
2、仪器
722分光光度计、试管、微量加样器
【实验操作】
1、蛋白质标准曲线的制备和待测血清蛋白含量的测定
取7支干净的大试管编号按下表加入试剂:
管号试剂(ml)
0123456
标准蛋白液(250μg/ml)
应用血清
生理盐水
碱性铜液
酚试剂
蛋白质含量(ug)
吸光度(A)
—0.10.20.30.40.5—
——————1.0
0.80.70.60.50.40.3—
2.02.02.02.02.02.02.0
混匀后置室温20分钟
0.20.20.20.20.20.20.2
加一管立即混匀一管,放置30分钟后,
用0号管调零,在650nm下比色。
0255075100125
2、根据标准管的蛋白含量和吸光度,以相当于每升血清中蛋白质的克数为横坐标,吸光度(A)为纵坐标。
绘制标准曲线并求出待测样品的蛋白质含量(mol/L)。
3、计算:
选一个和第6管(测定管)吸光度相近的标准管为标准,按下列公式进行计算。
×
10-6
1000
测定管的吸光度
标准管蛋白×
质含量×
血清蛋白质含量(g/L)==
0.002
标准管的吸光度
4、利用计算器求出未知样品的含量
实验三鼠肝肌动蛋白(β-actin)基因的检测
(一)鼠肝DNA的制备
【原理】
DNA是储存遗传信息的物质,是遗传的物质基础,它与生命的正常活动如种属遗传、生长发育有密切关系。
其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。
核酸广泛存在于生物中,DNA含有生物体的全部遗传信息,在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。
真核生物中,DNA主要存在于细胞核中,核外也有少量,如线粒体DNA,称为核外基因。
DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。
人类基因组含2.9×
109bp。
无论是研究核酸的结构,还是它的功能,首先需要对核酸进行分离与提纯。
分离与提纯
核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。
要从生物组织中提取DNA,因DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中故首先必须粉碎组织,裂解细胞膜和核膜,使DNP释放出来,再用苯酚提取蛋白。
由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取,故DNA沉淀中混有RNA。
需用核糖核酸酶(RNase)处理,去除RNA。
并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去,再经苯酚处理,乙醇沉淀,最后可得较为纯净的DNA。
它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知,一般以O.D280nm/0.D280nm能达到1.8左右为标准。
分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难,主要原因有:
(1)细胞内存在很高的DNA酶活性,在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。
(2)DNA分子很大,分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解,如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。
DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。
目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量,以下公式可作为紫外定量时参考:
双链DNA含量(μg/ml样品)=0.D260nm×
样品稀释倍数×
50μg/ml。
【器材】
1.塑料离心管:
6个
2.刻度离心管:
1支
3.滴管:
长:
1支吸酚:
氯仿混合液
中:
1支吸乙醇
短(钝口)1支吸DNA水溶液
4.细玻棒:
1个
5.移液管:
6.微量取样器1支
7.手套:
1副
8.离心机
9.紫外分光光度计
10.37℃水浴,50℃水浴
11.组织捣碎器
12.电泳仪及电泳槽
【试剂】
1.裂解缓冲液:
20mmol/LTris–HClpH7.4
20mmol/LEDTA
0.5%SDS
100mmol/LNaCl
配法:
1mol/LTris-HClpH7.450ml
20%SDS25ml
2mol/LNaCl50ml
0.5mol/LEDTA40ml
蒸馏水稀释至1000ml
其中Tris-HClpH7.4维持PH恒定,防止DNA变性和水解。
EDTA能络合二价金属离子,当Mg+2被络合后,细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制,以避免DNA的降解,同时金属离子络合后,细胞膜的稳定性下降,有利于膜的裂解;
SDS有使蛋白质变性的作用,它能破坏膜蛋白的构象,因此使膜裂解,它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离,并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
2.苯酚
重蒸苯酚加入抗氧化剂8-羟喹啉1mg/ml,用1mol/LPH8.0Tris-HCl洗一次,再用0.1mo1/LTris-HClPH8.0洗二次,苯酚PH在7.6-7.8之间。
3.苯酚:
氯仿混和液(1:
1)
苯酚加上等体积氯仿并用水饱和,混和液分层.上层为水相,下层为有机相且带黄色。
苯酚和氯仿都是蛋白质变性剂,苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿,但氯仿具有较好的分层作用。
4.无水乙醇
DNA在PH7.4条件下分子带负电,在NaCl存在条件下,DNA盐呈电中性,乙醇将DNA分子周围的水分夺去,DNA失水形成白色絮状沉淀。
5.TE缓冲液
50mmol/LTris-HClPH7.4
5mmol/LEDTA
1mol/lTris-HclPH7.410ml
0.5mol/lEDTA2ml
6.RNase10mg/ml
称取RNase溶解在10mmol/LTris–HCl(PH7.5)和15mmol/LTris—HCl(PH7.5)和15mm0l/LNaCl溶液中,使之浓度为10mg/ml。
100℃加温15分钟,使夹杂的少许DNase失活,然后慢慢冷却,分装于小管中-20℃保存。
7.蛋白酶K(10mg/m1)-20℃保存。
蛋白酶K优点是水解能力很强,作用广泛,可与SDS及EDTA合并使用。
8.20%SDS
9.0.5mol/LEDTA
10.12mol/L高氯酸
【操作】
1.取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水,用滤纸吸干后,-70℃冰箱中保存,用时取出。
2.取1克鼠肝加10ml裂解缓冲液,在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次,每次30秒)
3.取塑料离心管1支加入l/3支匀浆液(若匀浆液太稠,则再加入lmlTE缓冲液),然后再加入等体积苯酚:
氯仿混和液抽提。
每次抽提轻缓地来回摇动5分钟,然后10000转/分钟离心5分钟,水相吸入另一干净的离心管中。
重复抽提二次。
注意:
每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入,抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少,肉眼基本看不见。
若界面上变性蛋白质仍较多,可增加抽提次数。
4.水相加入一刻度离心管中后,加入2.5倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体积)。
加5mo1/LNaCl到终浓度为0.1mol/L,在离心管中轻缓的混匀,此时可见白色絮状沉淀,此即DNA粗制品。
5.用玻棒捞起DNA沉淀,放入小烧杯中,用70%乙醇洗涤沉淀一次,洗涤时动作要轻,防止DNA被切断。
6.沉淀取出放入一干净的塑料离心管中,用1mlTE缓冲液溶解。
7.在1mlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20μl,使最终浓度达到200ug/ml,37℃保温30分钟。
8.加入20%SDS25ul.使最终浓度至0.5%;
加入0.5mol/lEDTA30ul至20mol/l;
加10mg/ml蛋白酶K20ul,使最终浓度为200ug/ml,50℃保温30分钟。
9.加等体积苯酚:
氯仿混合液抽提,重复一次,去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质,至界面无明显的变性蛋白质为止。
每次抽提轻缓地来回摇动5分钟,离心10000转/分钟×
5分钟。
10.吸取水相,水相吸至一干净刻度离心管中量出积体,再加入2.5倍体积的冰无水乙醇,加5mol/LNaCl至终浓度为0.1mol/L,混匀后可得较纯的DNA沉淀,再用70%乙醇洗涤沉淀一次。
11.在一干净的塑料离心管中用0.3~0.5ml缓冲液溶解沉淀,得到提纯的DNA原液。
12.吸取DNA原液l00ul,用TE缓冲液稀释至3ml(1:
30稀释),(若DNA原液太浓,取原液50ul,太稀则取原液200ul)。
在紫外分光光度计中测定0.D260nm及0.D280nm的读数。
计算:
0.D260nm/0.D280nm比值,DNA浓度及DNA总量。
剩余原液写上自己的学号,保存,留作做PCR实验。
1.为尽可能避免DNA大分子的断裂,在实验过程中必须
(1)匀浆时应保持低温,匀浆时间应短,勿用玻璃匀浆器。
(2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短,并烧成钝口。
(3)酚抽提时勿剧烈振摇。
2.保持DNA活性,避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。
3.苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。
实验时,应戴手套操作,避免碰到皮肤,以免灼伤。
苯酚蒸汽毒性较大,实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。
4.离心时要注意管子间的重量平衡。
管子要对称放置,当离心达到所需速度后再开始计时。
【思考题】
1.如样品中有蛋白质存在,其紫外分析结果有何表现?
如何进一步纯化?
2.DNA的定量可采用那些方法?
目前常用的是哪种?
如何测定DNA的含量?
3.从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么?
应如何控制?
4.能引起DNA变性的因素有哪些?
DNA降解和DNA变性有何区别?
如何鉴别?
(二)用PCR技术检测β-actin基因
PCR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链反应,或体外扩增技术,是1985年美国cetus公司人类遗传部,加利福尼亚大学LosAngeles和Howghes医学院等联合创建的一项生物技术。
这项技术被广泛用于检测核苷酸变异和染色体重排、高效克隆某一基因片断,线粒体和基因组DNA的直接测序以及细菌、病毒、寄生虫所致疾病的诊断,在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等许多领域都有重要的实际应用价值。
之所以如此,就是因为PCR具有巨大的扩增能力,从一滴血、一根毛发、一个精子、一个细胞便可扩增出足量的特异DNA供分析、诊断与研究。
PCR的原理类似于天然DNA的复制,主要利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性,模仿体内的复制过程,在附加的一对引物(人工合成的寡核苷酸片断,它与待扩增片段两条链的两端DNA序列分别互补)之间引发聚合酶反应。
PCR全过程基于一套“三步曲”:
(1)DNA模板的变性,在95℃高温附近,模板DNA双链变性形成单链DNA而游离于反应溶液中;
(2)与附加引物退火,在降温过程中,加入反应体系中的两种引物将退火至相应互补的DNA链上;
(3)引物延伸(扩增步骤),将反应体系调到所选用的DNA聚合酶的最适温度(72℃左右),在4种dNTP存在下,DNA聚合酶延着引物和模板复合物,由5’一3’端延伸,而新合成的引物延伸链则可作为下一轮反应的模板。
以上“三步曲”即构成一个循环,如此重复进行,每循环一次,DNA分子数即按指数倍增(2”),若循环次数n=25,DNA即已比原来扩增了百万倍。
PCR技术原料简单,包括DNA样品,寡核苷酸引物,4种dNTP,合适的缓冲液及耐热的TaqDNA聚合酶,其中酶的活性、样品的浓度及纯度.引物的设计,缓冲体系是否合适,都会影响PCR的结果。
对大多数扩增反应而言,标准的PCR反应体系都是合适的:
标准PCR一般在50ul或100ul体积中进行。
包括:
50mMKCl,10mMTris-HCl,1.5mMMgCl2,100ug/ml明胶,0.25uM的引物,200uMdNTP,25u的Taq酶和DNA样品,为了封闭反应,防止蒸发,一般体系中加入矿物油。
扩增反应在DNA热循环仪或温控水浴锅中按设定程序进行,每个具体的PCR反应要想取得最好的结果,应当在标准体系的基础上,反复摸索,以选择最佳反应条件。
1.DNA扩增仪
2.20ul,200ul微量加样器
3.电泳仪、电泳槽
4.紫外透射分析仪
1.10×
PCR缓冲液:
0.1mol/LTris-Cl(PH8.3),0.5mol/lkCl,15mmol/LMgCl2,0.1%明胶
2.引物:
上游引物5’TGATGGTGGGAATGGGTCAGA3’
下游引物:
3’ACGGTTGGCCTTAGGGTTCAG5’
(β-actin扩增片数为)221bp
3.1.25mmol/ldNTP
4.50%甘油
5.TagDNA聚合酶(1u/μl)
PCR反应
1.PCR反应体系的建立。
按顺序在0.5ml塑料小试管中加入以下试剂:
10×
PCR缓冲液2.5ul
dNTP4ul
引物各1ul
待测样品(鼠肝DNA)3.0ul
H2O5.0
甘油5.0
TagE1ul
在震荡器上将各组份充分混匀,短暂离心后加一滴液体石蜡覆盖于液体表面。
2.扩增
将加好样的试管置于DNA扩增仪上,按94℃20S,45℃20S,72℃40S的条件扩增30个循环。
1.PCR反应体系中各成份在PCR反应中的作用?
2.污染是PCR反应中最常见的问题,可采用哪些措施,防止污染?
(三)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段
在pH8.0~8.3的缓冲液中,核酸分子带负电荷,向正极移动。
由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同(忽略碱基上的部分电荷,每个核苷酸残基都带一个负电荷),因此在自由泳动时.各种核酸分子的迁移率相似,无法分开。
然而,在浓度适当的凝胶中,由于分了筛效应,使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异,从而把它们分开。
核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度,与分子的碱基组成及电泳温度(4℃~30℃之间)无明显关系。
一般说,同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比,与电场强度(小于5V/cm)成正比。
在核酸胶电泳中最常用的pH=8.3的TBE缓冲液(0.089mol/LTris-Borate一0.002mol/LEDTA)和TAE缓冲液(0.04mol/LTris—Acetate一0.002mol/LEDTA),也可用pH7.0,0.01mol/L的磷酸缓冲液。
TBE缓冲液的缓冲能力较强。
在电泳过程中需再指示剂指示核酸迁移情况,常用的指示剂是溴酚蓝(Bromophenolblue,Bb,蓝紫色)和二甲苯蓝(Xylenecyanol,Xc,蓝色)。
溴酚蓝的分子量很小。
仅670,在通常使用的不同浓度胶中电泳时近似于自由电泳,不存在分子筛效应,所以迁移速度基本相同。
二甲苯蓝的分子量仅554.6,在不同浓度胶中迁移速度也基本相同。
二甲苯蓝带电荷量与溴酚蓝不同,所以在同一浓度胶中迁移速度比溴酚蓝慢。
这两种指示剂在不同浓度胶中迁移速度与一定长度的核酸分子相当,如在5%的聚丙烯酰胺胶中,Bb与Xc的迁移速度分别与65核苷酸和260核苷酸相同,在7~8mol/L尿素-5%聚丙烯酰胺中则相当于35和130核苷酸片段。
在0.6%、1.0%、2%的琼脂糖胶中.Bb的迁移速度大致与lkb、0.6kb和0.15kb的双链DNA片段相同。
因此,按照所要分离的核酸分子大小,可以根据指示剂迁移情况来决定电泳时间。
电泳样品中除了加指示剂外,为了使加样品能沉入胶孔,还要加入适量蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。
电泳后的核酸要经过染色才能显示出条带。
常用染色剂有溴乙锭(Ethidiumbromide,TEB)吖啶橙(Acridineorange,Ao)。
荧光染料溴乙锭是扁平分子,它可以嵌入核酸双链的碱基对之间,当受紫外光激发时,发射590nm的红色荧光。
EB-DNA复合物的荧光比EB本身发射的荧光强许多倍。
因此一般不必洗去背景就可观察到核酸电泳带。
如果背景太深条带不够清晰,可将胶浸泡于1mmol/LMgS04中1小时或10mmol/LMgCI2中5分钟,使非核酸结合的EB退色。
染色一般在电泳结束后进行,将胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10分钟即可。
EB见光会分解,染色时应避光。
染色与电泳同时进行,只须制胶时将EB加入胶内使浓度达0.5μg/ml,这样可在电泳过程中随时观察核酸迁移情况。
EB带正电荷,会中和核酸分子的负电荷,同时由于它的嵌入增加了
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