我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定Word格式.docx

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杂交水稻;

遗传标记;

纯度;

鉴定

中图分类号:

Q943;

S511103文献标识码:

A文章编号:

100127216（20030120001205

　　我国是世界上第一个在生产上利用水稻杂种优势的国家,目前杂交稻播种面积约1333万hm2,占水稻播种总面积的60%左右[1],而生产上面临的一个突出问题就是种子纯度问题。

利用酯酶同工酶[2~4]和RAPD标记技术[5~9]对杂交稻组合及其亲本进行鉴别和纯度分析已有报道,但这些技术都有一定的局限性。

如酯酶同工酶多态性较差,只能区别部分品种;

而RAPD技术为显性标记,稳定性较差,难以区分杂交种及其亲本,因此限制了其在生产上的应用。

SSR（SimpleSequenceRepeats标记是指以2~6个碱基为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列,为共显性标记。

由于SSR技术具有简便、快速、稳定性高和等位基因多态性高的特点,在遗传图谱构建[10,11]、遗传多样性分析[12]和系统学研究[13,14]方面有广泛的应用。

SSR广泛、随机、均匀地分布于水稻基因组[15,16],Akagi等[17]采用20个微卫星位点分析了59个日本粳稻品种的遗传多样性,发现17个微卫星位点就能够将59个品种区别开,大部分的品种可通过5个微卫星位点加以鉴别。

SSR的高分辨力及其共显性遗传特点可用于杂交种纯度鉴定,而且快速稳定、成本低廉、多态性丰富,为在生产上应用提供了可能。

本实验根据水稻染色体公共遗传图谱[18~20],选择了位于不同连锁群上的26对SSR引物,构建了9个杂交稻组合及其亲本的SSR指纹图谱,并对汕优63和两优培九两个品种进行了纯度分析,旨在建立一套适用于杂交水稻品种鉴定的稳定的SSR技术体系。

1　材料与方法

1.1　材料

选用近几年播种面积在全国前几位的杂交稻组合及其亲本,还有2个超级稻品种,覆盖了杂交稻播

收稿日期:

2002203220;

修改稿收到日期:

2002204208。

基金项目:

国家农业科技跨越计划（1999201215;

农业部水稻学重点实验室开放项目（000203。

第一作者简介:

彭锁堂（1964-,男,副教授,在职博士研究生。

1

中国水稻科学（ChineseJRiceSci,2003,17（1:

1~5　

种总面积的30%以上。

其中包括7个水稻胞质雄性不育系（V20A、珍汕97A、协青早A、龙特甫A、冈46A、232A、培矮64S,6个保持系（V20B、珍汕97B、协青早B、龙特甫B、冈46B、232B,7个恢复系（密阳46、明恢63、9308、盐恢559、CDR22、838、9311及8个三系杂交组合（威优46、汕优46、汕优63、协优63、协优9308、特优559、冈优22、优838和1个两系杂交组合（两优培九。

1.2　DNA的提取方法

取数粒水稻干种子或幼苗,,

石英砂或倒入液氮

心管中,

1.2.1　SDS

加600ΛL（100mmolLTris2HCl,pH8.0,50mmolLEDTA,pH8.0,0.5molLNaCl,1.5%SDS,65℃水浴30min,12000rmin、4℃离心10min。

取上清液加入等体积的酚氯仿混匀,12000rmin下离心5min。

取上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA,10000rmin下离心5min,倒掉上清液,用70%酒精、无水酒精清洗,空气干燥。

加入200ΛLTE,-20℃贮存备用。

1.2.2　CTAB法

加600ΛL提取缓冲液（2%CTAB,100mmolLTris2HCl,pH8.0,20mmolLEDTA,pH8.0,1.4molLNaCl,2%ME,55℃水浴40min.加入等体积的氯仿异戊醇,13000rin、15℃下离心15min,110CTAB、等体积氯仿戊,r℃下离心15in液加积沉淀缓冲液（1%lTris2HCl,pH8.0,10mmolLpH8.0,1%ME,室温下静置30min以上,10000rmin、4℃下离心10min,沉淀DNA。

沉淀稍干后,加入300ΛL高盐TE（10mmolLTris2HCl,pH8.0,1mmolLEDTA,pH8.0,1molLNaCl,1.5%SDS,1ΛgmLRNase溶解,37℃水浴1h以上。

酚氯仿抽提1次,异丙醇沉淀DNA,70%酒精、无水酒精清洗,空气干燥。

1.3　SSR分析

选用的26对SSR引物购自ResearchGeneticsInc.（表1。

10ΛL的反应体系中包括20ng的模板DNA,1.5mmolLMg2+,0.36ΛmolL3’和5’端

表1　SSR引物及其序列

Table1.SSRprimersandsequences.

引物Primer

染色体

Chromosome

引物序列（5’-3’Primersequence

正向引物Forwardprimer反向引物Reverseprimer

RM11ACCATGGATGGTACCAACTCTTCGCTTGCATCTACTATGC

RM135TCCAACATGGCAAGAGAGAGGGTGGCATTCGATTCCAG

RM163CGCTAGGGCAGCATCTAAAAACACAGCAGGTACGCGC

RM1712TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTCGGTGATCCTTTCCCATTTCA

RM187TTCCCTCTCATGAGCTCCATGAGTGCCTGGCGCTGTAC

RM1912CAAAAACAGAGCAGATGACCTCAAGATGGACGCCAAGA

RM223GGTTTGGGAGCCCATAATCTCTGGGCTTCTTTCACTCGTC

RM258GGAAAGAATGATCTTTTCATGGCTACCATCAAAACCAATGTTC

RM306GGTTAGGCATCGTCACGGTCACCTCACCACACGACACG

RM517TCTCGATTCAATGTCCTCGGCTACGTCATCATCGTCTTCCC

RM707GTGGACTTCATTTCAACTCGGATGTATAAGATAGTCCCC

RM1194CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTGCGCCGGATGTGTGGGACTAGCG

RM20211CAGATTGGAGATGAAGTCCTCCCCAGCAAGCATGTCAATGTA

RM20611CCCATGCGTTTAACTATTCTCGTTCCATCGATCCGTATGG

RM2082TCTGCAAGCCTTGTCTGATGTAAGTCGATCATTGTGTGGACC

RM2108TCACATTCGGTGGCATTGCGAGGATGGTTGTTCACTTG

RM2121CCACTTTCAGCTACTACCAGCACCCATTTGTCTCTCATTATG

RM2147CTGATGATAGAAACCTCTTCTCAAGAACAGCTGACTTCACAA

RM2159CAAAATGGAGCAGCAAGAGGTGAGCACCTCCTTCTCTGTAG

RM2199CGTCGGATGATGTAAAGCCTCATATCGGCATTCGCCTG

RM2256TGCCCATATGGTCTGGATGGAAAGTGGATCAGGAAGGC

RM22810CTGGCCATTAGTCCTTGGGCTTGCGGCTCTGCTTAC

RM2414GAGCCAAATAAGATCGCTGATGCAAGCAGCAGATTTAGTG

RM24410CCGACTGTTCGTCCTTATCACTGCTCTCGGGTGAACGT

RM2495GGCGTAAAGGTTTTGCATGTATGTTGCCATGAAGGTCAGC

2中国水稻科学（ChineseJRiceSci　第17卷第1期（2003年1月

引物,0.2mmolLdNTP,5×

SSRbuffer2.0ΛL的

模板DNA,1.5mmolLMg2+

0.36ΛmolL3’和5’端引物,0.2mmolLdNTP,5×

SSRbuffer2.0ΛL和1.0UTaqDNA聚合酶。

反应在PTC2200PeltierThermalCycler上进行,扩增条件为94℃预变性45s;

94℃下45s,56℃下45s,72℃下1min,30个循环;

最后72℃下8min。

扩增产物在310%的Metaphor琼脂糖凝胶（FMC上电泳。

分子量标准为100bpDNALadderPlus（MBI锭染色后应用凝胶图像GDS2（22.1DNA结果

图1DNA用6个引

物扩增的SSR结果。

从图1中可以看出,所有6个引物用CTAB法提取的模板DNA,不管是种子、幼苗,是否用液氮,均获得了扩增条带;

而用SDS法提取的模板DNA,只有幼苗获得了扩增条带。

说明SSR对模板DNA还是有一定的要求,SDS法相对于CTAB法,DNA未经纯化和RNA酶处理,种子中所含大量多糖和蛋白等对SSR结果有较大的影响,而幼苗中多糖和蛋白含量较低,对扩增结果影响不大。

CTAB法经过2次沉淀和1次酚

氯仿抽提及RNA酶处理,种子DNA纯度有很大提高,扩增效果良好。

使用液氮研磨,无论种子还是幼苗都得到一致的扩增结果,说明一定量DNA的降解对SSR扩增结果影响不大。

2.2　主要杂交水稻组合及其亲本SSR多态性分析　　共选用能覆盖水稻12条染色体的26对SSR引物对9个杂交稻组合及其亲本进行了PCR扩增,

结果有24对引物可以扩增出条带,只有引物RM51和RM70没有扩增出条带。

24对引物中,引物RM22、RM244、RM250没有多态性,其余21对引物共扩增出多态性条带62条,每对引物可扩增的多态性条带数目不等,为2~5条,2.95条。

引物228本2,。

利用,只有冈46A和2,。

恢复。

RM17虽然只能区别9个杂交组合中的5个,但杂交组合只有2条带,为父母本完全互补型,而且条带清晰明亮（图2,很适宜品种纯度鉴定。

SSR为共显性标记,所有杂交组合均是父母本条带的完全互补型,可以很好地区分杂交组合和父母本,而且多态性高,是品种认证和纯度鉴定理想的分子标记。

2.3　两份杂交水稻组合纯度鉴定

图3和图4分别是汕优63和两优培九各100粒种子的SSR（RM17电泳检测结果。

汕优63的

100粒种子中,有3粒是母本类型,4粒是父本类型,93粒是杂种类型。

因为在提取DNA之前,在样品中

混入3%的父本种子,SSR检测纯度应该是96.0%。

而田间检测实际纯度为96.2%,两者是比较接近的。

我们又用引物RM228进行检测,得到了同样的结果。

两优培九100粒种子中,有2粒属母本类型,3粒属父本类型,95粒属杂种类型,除去混入的3%父本种子,SSR检测纯度为98.0%,也与田间检测纯度97.7%相接近。

说明用SSR检测杂交水稻种子纯度是完全可行的。

图1　不同提取方法DNA6个引物的SSR扩增结果

Fig.1.AmplificationresultsofsixSSRprimerswithDNAextractedbydifferentmethods.

、、、、、分别是引物RM17、RM22、RM25、RM225、RM249、RM250的SSR结果。

1-SDS,种子,液氮;

2-SDS,幼苗,液氮;

3-SDS,种子;

4-SDS,幼苗;

5-CTAB,种子,液氮;

6-CTAB,幼苗,液氮;

7-CTAB,种子;

8-CTAB,幼苗;

M-SSR标记。

,,,,wereamplificationresultsofSSRprimersRM17,RM22,RM25,RM225,RM249andRM250,respectively.

1-SDS,seeds,liquidnitrogen;

2-SDS,seedlings,liquidnitrogen;

3-SDS,seeds;

4-SDS,seedlings;

5-CTAB,seeds,liquidnitro2

gen;

6-CTAB,seedlings,liquidnitrogen;

7-CTAB,seeds;

8-CTAB,seedlings;

M-SSRmarker.

3

彭锁堂等:

我国主要杂交水稻组合及亲本SSR标记及其纯度鉴定

图2　引物RM228和RM17的SSR扩增结果（左图为引物17

Fig.2.AmplificationresultsofprimerRM228and17（eft:

per:

primerRM17.

M-SSR标记;

1-V20A;

2-V20B;

46;

4-6-珍汕97A;

7-珍汕97B;

8-汕优63;

9-明恢63;

10-协优63;

11-协青早A;

12-B;

A;

16-龙特甫B;

17-特优559;

18-盐恢559;

19-冈46A;

20-冈46B;

21-冈优23-224-232B;

25-优838;

26-838;

27-培矮64S;

28-两优培九;

29-9311。

M-SSRB;

3-46;

4-Milyang46;

5-Shanyou46;

6-Zhenshan97A;

7-Zhenshan97B;

8-Shan2you63;

9-M10-X11-XieqingzaoA;

12-XieqingzaoB;

13-Xieyou9308;

14-9308;

15-LongtefuA;

16-LongtefuB;

17-Teyou559;

19-Gang46A;

20-Gang46B;

21-Gangyou22;

22-CDR22;

23-232A;

24-232B;

25-you838;

27-S;

28-Liangyoupeijiu;

29-9311.

图3　RM17对汕优63100粒单种子的SSR扩增结果

Fig.3.AmplificationresultsofprimerRM17with100singleseedsofShanyou63.

↓为母本类型;

↑为父本类型。

↓Standsformaternaltype;

↑Standsforpaternaltype.

图4　RM17对两优培九100粒单种子的SSR扩增结果

Fig.4.AmplificationresultsofprimerRM17with100singleseedsofLiangyoupeijiu.

↑为母本类型;

↓为父本类型。

↑Standsformaternaltype;

↓Standsforpaternaltype.

3　讨论

大多数学者以新鲜叶片或发芽幼苗提取DNA进行PCR扩增,但用新鲜叶片或幼苗提取DNA,需要发芽,不仅费时,而且提取过程需要液氮,非常麻烦。

进行品种鉴定和纯度分析时,往往材料数量很多,为了缩短实验周期,减少工作量,最好用干种子提取DNA。

我们用SDS和CTAB两种方法提取干种子DNA,发现所有引物用CTAB法提取的DNA,扩增条带清晰,效果良好;

而SDS法提取的DNA均未扩增出条带。

可能是因为干种子中含有大量的多糖和蛋白质,对PCR扩增影响较大。

CTAB有去除

4中国水稻科学（ChineseJRiceSci　第17卷第1期（2003年1月

多糖和蛋白质的作用,经过2次沉淀和RNA酶处理,所提的DNA纯度较高;

而SDS法提取的DNA去除杂质不彻底,影响了扩增结果。

所以用干种子作材料时,最好用CTAB法来提取DNA;

而用叶片和幼苗作材料时,用SDS法也可以。

SSR标记对杂交水稻及其亲本材料具有很好