乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒胶体金法生产工艺研究及反应体系的建立研究资料Word下载.docx
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1.1金标抗体反应膜制备
1.1.1参数设置
表1胶体金标记参数
A104
胶体金—CG(单位:
g/ml)
A103
最适OD值
配对宽度(mm
原料名称
最适标记量
0.8%
鼠抗HBsAg单克隆抗体B
15
0.4%
35
7.5±
1
1.1.2金标反应膜制备/HBSAg)
表2金标反应膜清单
物料编码
辅料名称
规格
批配料量(1000板)
F-002-3
无纺布
38cmX27cm
30张
Y-002/HBsAg
/
120mg
注:
(1)Y-002/HBsAg的包装规格可以不同,但是总量一定。
(2)此规格每张有效长度均以34cm计,折合34板(每板宽度1cm)。
1.1.2.1胶体金溶液制备
在加热煮沸的3800ml纯化水中快速加入A102溶液80ml,待溶液再次沸腾后,迅速加入A101溶液80ml,继续煮沸,观察溶液颜色由黄色变黑再变紫,最后变成稳定的酒红色后,计时继续加热10分钟即可。
待溶液冷却至室温后,加入纯化水补充至4000ml。
共制备2瓶。
备注:
每1000板需要该比例胶体金溶液的体积为8000毫升。
1.1.2.2胶体金-抗体结合物制备:
标记原料:
鼠抗HBs单克隆抗体B(Y-002/HBsAg)
每4000ml胶体金溶液,首先加入32mlA104,混匀,将上述胶体金溶液按照15卩g/ml的比例加入Y-002/HBsAg(即每1000ml需要Y-002/HBsAg的重量为15mg),混匀,静置5分钟,然后加入A103溶液16ml,混匀,静置5分钟。
经3次30分钟的离心,离心速度为:
5000rpm7000rpm9000rpm,合并三次收集的沉淀(体积V。
1.123金标反应膜制备
合并沉淀体积为V,取30ul沉淀100倍稀释测524nmOD值A(A>
0.5),按
100A*V=35*V2加金标结合物稀释液稀释沉淀至体积V即制得金标抗体溶液;
将制得的
金标抗体溶液按每张无纺布涂布10ml均匀涂布,室温晾干18-20小时即可。
1.1.2.4分切
将晾干的金标反应膜按照中间体配对确定的宽度进行分切(通常7.5±
1mm)记做
生产中间体条组分S4铝箔袋密封,室温存放。
1.2硝酸纤维反应膜制备
表3包被参数
检测线—T(单位:
mg/ml)
对照线—C(单位:
稀释浓度
鼠抗HBsAg单克隆抗体A
Y—001/HBsAg
1.5
Y—003/GAM
1.0
表4硝酸纤维素膜固相准备
F-001-3
硝酸纤维膜
27cmx16cm
125张
HBsAg01
HBsAg01包被液
1.5mg/ml
60mg
HBsAg03
HBsAg03包被液
1.0mg/ml
40mg
(1)每ml包被液可以包被25板;
每1000板需要40ml包被液;
(2)每张硝酸纤维膜计为8板;
(3)硝酸纤维反应膜沿膜上密虚线标志线分切。
1.2.1包被
(1)抗HBs单克隆抗体A(检测线)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)使用B101分别稀释至1.5mg/ml、1.0mg/ml,分别加入喷点包被机的1号杯、2号杯;
⑵调试自动喷膜机,喷液量设定为1.4卩l/cm,导轨速度6.0cm/sec。
喷嘴1与2间隔5mm。
(3)包被后的硝酸纤维素膜过夜晾干。
1.2.2封闭
(1)按每100mlB102+900ml纯化水浸泡5张(折40板)膜计,将包被好的膜浸入封闭2小时;
(2)将膜取出沥干,过夜晾干,即制得硝酸纤维反应膜,存干燥盒转入中间站待验,待
检合格后沿膜上密虚线标志线分切。
1.2.3分切
按照膜面标志线分切,每张8板。
记做生产中间体条组分S1。
铝箔袋密封,室温存放。
2、建立的反应体系
2.1样本要求
1)样本采集前对受检者无特殊要求,不需禁食,按照常规的实验室程序收集血清/血浆标本。
2)样本收集后应尽快分离血清/血浆以避免融血。
严重溶血和乳糜样本不能用于检测,
以免引起误判;
已经进行加热处理的样本及已被微生物污染的样本不能用于检测。
3)血清样本应收集在不含任何抗凝剂的试管中,血浆样本应收集于含有正常使用量柠
檬酸钠、肝素、EDTA等抗凝剂的容器中。
如果需要,样本中可加入0.1%叠氮钠作为防
腐剂。
4)样本收集后应尽快检测,不能将样本在室温放置太长的时间。
如果收集的当天不使
用,应当冷藏2-8C保存,超过7天应当冷冻于-20C保存。
应尽量避免反复冻融,使用前不得超过2-3次。
5)检测前应将样本恢复至室温,冷冻的样本应等完全融化后方可使用。
2.2检验方法
检测试剂、待检样品和其它检测用材料等测试前需平衡至室温:
1)打开铝箔袋,取出检测试剂。
2)试条:
持试条将有箭头标志线一端插入样本收集容器中,确保样本液面直到标记线
且浸没时间至少10秒(注:
深度不可超过标志线横线),然后取出平放或粘切在测试卡(可用记录纸代替);
或者直接在试纸条/板样品垫端加样处滴1-2滴(60-80卩I)待测样本,开始计时观察测试结果;
试盒:
用塑料滴管在试剂盒加样区中心缓慢滴加2-3滴血清或血浆样本(约
60-100卩I,开始计时观察测试结果。
3)等待红线出现,应在10-20分钟时观察反应结果,30分钟结果判定无效。
2.3检验结果的解释
1)阳性结果:
出现两条红色条带,一条位于检测线区内,另一条位于对照线区内。
表明测试样本中检出乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg);
2)阴性结果:
仅出现一条红色条带,即对照线区内出现红色条带,检测线区内无有色
条带出现。
表明测试样本中未检出乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg);
3)无效结果:
当对照线区内未出现有色条带,表明试验失败或试剂失效,需进行重复检测。
主要生产工艺描述(固相载体、显色系统、指示系统等)
及确定依据;
1主要材料
(1)主要原料
鼠抗HBsAg单克隆抗体A(包被检测线)鼠抗HBsAg单克隆抗体B(胶体金标记)⑵辅料
硝酸纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维、无纺布、箭头胶、双面胶带、塑料基板、
⑶化学试剂
Tris、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、BSAEDTATween-20抗体稀释液;
氯金酸、
柠檬酸三钠、PH调节剂、胶体金标记物稳定液
(4)测试样本
包括本公司自己制定的内质控参考品、中国药品生物制品检定所提供的HBsAg酶标类国家标准品。
按照各自的说明书进行使用和结果判断。
2实验仪器:
自动喷膜机美国BIO-DOT公司XYZ3050
封口机温州兄弟SF-150
切条机
咼速冷冻离心机
BECKMANJ2-MC
紫外分光光度仪
HeliosGramma
电子分析天平
SartoriusBS210S
生物安全柜
上海瑞仰BSC
nB-1101
压力火菌器
上海博迅YXQ-LS-18SI
微量加样枪、刻度吸管、酶标板、纯水机等。
3操作
3.1固相硝酸纤维素膜
3.1.1对照线喷液量的选择
将纯化好的羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释到浓度为1mg/ml,用自动喷膜机喷涂质控线,喷膜量分别为1.6卩l/cm、1.4卩l/cm、1.2卩l/cm,比较用不同喷膜量所得的划线效果。
结果表明1.4卩l/cm喷膜量时所划线边缘整齐,线条精细。
3.1.2硝酸纤维素膜检测线与对照线抗体的包被
当喷膜量为1.4卩l/cm将抗HBs单克隆抗体A稀释稀释至1mg/ml,对照线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml,分别包被硝酸纤维素膜的检测线与对照线。
室温干燥过夜,37C封闭4h。
储存备用。
3.2胶体金一抗体结合条件选择
3.2.1胶体金溶液的制备
该产品使用的胶体金是柠檬酸三钠还原法制备的,具体方法如下:
1)加热一份100毫升纯化水,煮沸后快速加入2.0ml胶体金氧化剂;
2)再加入2.0ml的胶体金还原剂,继续煮沸,观察溶液颜色由黄色变黑再变紫,最后
变成稳定的酒红色后,继续煮沸10min,停止加热,室温冷却。
3)将冷却后的胶体金溶液补水至100ml,使用紫外扫描检定,进行400-600nm紫外扫描,确定最大吸收峰波长,观察最大吸收峰的峰型和峰宽。
表1胶体金一览表
A102(ml)
A101(ml)
颜色
最大吸收波长(nm)
酒红
524
3.2.2鼠抗HBs单克隆抗体B与胶体金结合pH范围确定
1)取9个1ml离心管,每管加入1ml2:
2的胶体金溶液;
2)每管分别加入pH调节剂0"
、2"
、4d、6pl、8pl、10d、12d、14d、16pl;
3)取一48孔酶标板,按照pH调节剂的加入量从低到高分别将上述胶体金取100J加
入孔中,重复三次;
4)每孔分别加入2"
浓度为1mg/ml的鼠抗HBs单克隆抗体B,混合,室温静置5min;
5)每孔分别加入100d浓度为10%NaC溶液,混合,室温下静置5min;
6)观察胶体金颜色变化,记录保持红色的最低pH调节剂体积;
7)胶体金颜色变化直到室温下放置2小时,记录仍保持红色的最低pH调节剂的体积;
结果见表2:
表2最佳pH实验结果
5
6
7
8
pH调节剂
2d
4d
6d
8d
10d
12d
14d
16d
结果
紫黑色
刁弋八、、11
紫红色
酒红色
根据上述检测结果,稳定的胶体金溶液是酒红色,根据胶体金颜色变化,选择按照不低于0.8%比例加入pH调节剂。
3.2.3最小蛋白浓度的确定
1)取一48孔酶标板,每孔分别加入含0.8%pH调节剂的2:
2胶体金100d,加9孑L;
2)各孔依次加入鼠抗HBs单克隆抗体B(浓度为0.5mg/ml)1"
、1.5d、2d、2.5d、3d、3.5d、4d、4.5d、5d,混匀,室温放置5分钟;
3)每孔分别加入100d浓度为10%NaC溶液,混合,室温下放置5分钟;
结果见表3:
表3最小蛋白浓度实验结果(浓度:
(⑷/ml))
HBsAb浓度
项目j、、、
7.5
10
12.5
17.5
20
22.5
25
胶体金
2:
0.8%
显色
紫黑
紫红
根据上述检测结果,当标记抗体的量不足,则不能稳定胶体金溶液,所以根据胶体
金颜色变化,我们选蛋白浓度15dg/ml为鼠抗HBs单克隆抗体B与2:
2胶体金结合的最小蛋白标记浓度;
3.3抗HBs-GOLD勺制备
3.3.1胶体金溶液的选择
3800ml纯化水加热至沸腾后快速加入80毫升胶体金氧化剂,同时分别加入胶体金还原剂80毫升,继续煮沸,观察溶液颜色由黄色变黑再变紫,最后变成稳定的酒红色后,计时继续煮沸10分钟,室温下冷却,用纯化水恢复至4000ml;
3.3.2胶体金结合物制备
1)分别取100毫升2:
2胶体金溶液,按照0.8%的比例加入pH调节剂800卩l,混匀;
静置5min;
2)在2:
2胶体金溶液中,按照每毫升胶体金溶液15旧的比例加入鼠抗HBs单克隆
抗体B,共1.5mg,混匀;
静置5min;
3)分别按照0.4%的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升,混匀,静置5分钟;
4)5000、7000、9000rpm离心30min,分别收集沉淀,合并三次收集的沉淀。
3.3.3操作
3.3.3.1涂布预检
将离心后的胶体金抗体结合物100倍稀释测定A524nm,根据以往实验结果,用金标结合物稀释液作为金标抗体的稀释液将胶体金抗体结合物稀释至40D,将稀释后的抗体工
作液按照每1毫升涂布100cm无纺布,37E干燥4小时,裁切宽度为1cm与样品垫、固相反应膜等其它辅料依次粘贴,切条后检测内质控参考品。
表4涂布预检结果
内质控参考品
P1
P2
N2
N4
检测结果
+
-
1ng/ml
2n/ml
2.5ng/ml
3ng/ml
±
由实验结果可知:
1)检测强阳性样本P1、P2结果均为阳性,检测阴性样本N2、N4,结果均为阴性,故2:
2胶体金标记抗体,选择0.8%比例加入A104,并以15^/ml的抗体浓度进行标记结果符合要求。
2)检测2.5ng/ml与3ng/ml标准品时,出现假阴。
建议加大检测线包被浓度,提高
灵敏度,去除假阴。
3.332检测线包被浓度的确定
当喷膜量为1.4卩l/cm将抗HBs单克隆抗体A稀释成不同浓度:
3mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/mI,分别和1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体同步喷涂硝酸纤维素膜。
用制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条,测试内质控灵敏度参考品,在30分钟内判定结果,检测结果如下:
表5检测线不同包被量对应的检测结果
包被浓度
检测样本
3mg/ml
2.5mg/ml
2mg/ml
一
2ng/ml
2.5ng/ml
实验结果表明,检测线包被浓度过小时,弱阳性标本容易出现漏检;
包被浓度过大,将使产品的灵敏度太高,则容易出现假阳性条带。
1)1mg/ml包被浓度过低,导致灵敏度不足,检测2.5ng/ml与3ng/ml参考品均出现假阴。
而3mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml1.5mg/ml包被浓度过高,检测1ng/ml与2ng/ml均出现假阳,结合成本考虑,选择1.5mg/ml为抗HBs单克隆抗体A的包被浓度;
2)1.5mg/ml包被浓度检测2ng/ml及1ng/ml参考品时仍出现假阳,故建议提高胶体金工作液的稀释倍数以降低灵敏度。
3.3.3.3鼠抗HBsAg单克隆抗体B-GOLDL作液稀释倍数确定
用金标结合物稀释液作为金标抗体的保护液,将离心后的胶体金抗体结合物100
倍稀释测定A524nm,体积V,分别按照100A24^V1/30、100A24nmV1/35、100A24nmV1/40计算稀释后的体积7。
将稀释后的抗体工作液按照每1毫升涂布100cm无纺布,37C干燥4小时,与样品垫、固相反应膜等其它辅料依次粘贴,裁切宽度为1cm检测内质控灵敏度参考品,比较检测试条的效果。
表6鼠抗HBsAg抗体-GOLD工作液稀释倍数确定
稀释倍数
1/30
1/35
1/40
100A524nm,V1/30、100As24nm,V1/35、100As24nm,V1/40分别用1/30、1/35、1/40代替。
1)结果表明随着稀释倍数的增加,检测试条的灵敏度降低;
反之,灵敏度提高。
1/30计算金标抗体工作液稀释体积时,检测2.5ng/ml及3ng/ml阳性参考品均出现假阴,而1/40检测1ng/ml及2ng/ml标准品时则出现假阳;
2)1/35计算金标抗体工作液稀释体积时虽然检测2ng/ml标准品时仍出现假阳,但检测1ng/ml及2.5ng/ml、3ng/ml标准品时均符合要求,故选择1/35计算金标抗体胶体金工作液稀释体积。
3)建议减小裁切宽度以降低灵敏度,消除假阳。
3.334鼠抗HBsAg抗体-GOLD反应膜组装(裁切)宽度优化
将预先吸附有鼠抗HBsAg抗体-GOLD结合物的无纺布膜干燥后,裁成不同的宽度,与固相载体硝酸纤维反应膜以及其它辅料依次粘贴后,裁切成试纸条,测试内质控灵敏
度参考品,结果如下,
表7鼠抗HBsAg抗体-GOLD反应膜组装(裁切)宽度选择
〜'
〜S<
宽度(mm)
检测浓度
5.5
6.5
8.5
9
从上述结果可以看出,当宽度为5mm检测2.5ng/ml与3.0ng/ml时均出现假阴性,宽度小于6mn时,检测2.5ng/ml标准品出现假阴;
宽度为9mm寸,检测2ng/ml样本与时出现假阳,而6.5、7、7.5、&
8.5mm裁切宽度检测阴性及阳性标准品时均符合要求,故选择金标抗体无纺布裁切宽度为7.5±
1mm
3.3.3.5对照线包被浓度的确定
确定包被体积后(1.4卩l/cm),将稀释成不同羊抗鼠IgG抗体浓度:
2mg/ml、
1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml,进行硝酸纤维素膜喷涂,重复做三批。
用制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条,通过检测1份内质控强阳性参考
品、1份内质控阴性参考品,在30分钟内判定结果,比较对照线的显色情况,结果如下表,
表8对照线显色情况
浓度及S1
批次
1mg/ml
0.5mg/ml
Iot1
lot2
lot3
lot1
+++
++
N3
试验结果表明,对照线抗体的浓度小于1mg/ml时,对照线显色不是很明显,当达
到1mg/ml以上时,显色情况就比较好,由于浓度选得太高,不仅增加成本,而且存在扩散的可能性,造成一定的假阳性。
因此,选择1mg/ml为对照线的包被浓度。
3.336鼠抗HBsAg抗体-GOLD吉合物反应膜干燥条件选择
将鼠抗HBsAg抗体-GOLD吉合物工作液稀释后,以每毫升100cm的面积均匀涂布在无纺布上,进行干燥条件的比较试验。
根据以往经验,胶体金标记蛋白在-20C冷冻干
燥并不稳定,因此我们选择了37C、室温两种条件进行干燥试验,测试内质控灵敏度参考品,30分钟判断结果。
表9鼠抗HBsAg抗体-GOLD结合物反应膜干燥比较
条件及时间
37C
室温
2(h)
4(h)
6(h)
5(h)
10(h)
15(h)
通过上述的试验结果,室温、37E干燥过程中,涂布抗HBs-GOLD吉合物稀释液的无纺布反应膜的颜色从红色变为略有发蓝。
我们通过对室温、37T的产生的结果对比,即当室温5小时时,37E干燥2h时,无纺布干燥不彻底,胶体金-抗体爬升速度较慢,增加了结果判定时间,同时会出现假
阳性。
室温超过10小时、37C超过4小时时,检测结果符合要求,结果判断直观。
在这里我们通过控制室温和相对湿度,选择室温过夜晾干(温度为18〜26C,相对湿度小于45%)
3.3.3.7包被硝酸纤维素膜的干燥选择
设定不同的干燥条件:
室温(6小时、12小时、16小时、18小时)、37E干燥不同时间(4小时、8小时、12小时、16小时),湿度均低于45%封闭后再次经37T干燥4小时后,与制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条,检测内质控参考品,在30分钟内判定结果。
表10包被膜干燥选择
37C干燥
6(h)
12(h)
16(h)
18(h)
8(h)
12(h)
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