DNA甲基化及其检测.ppt
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DNA甲基化及其检测.ppt
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DNA甲基化及其检测方法武汉大学中南医院基因诊断中心郑芳纲纲要要表观遗传学表观遗传学DNA甲基化甲基化DNA甲基化检测方法甲基化检测方法研究进展研究进展一、表观遗传学一、表观遗传学基因型相同基因型相同现象现象11:
一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同表达模式迥异表达模式迥异现象现象2:
同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。
但同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。
但他们往往在长大成人后在性格他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往健康方面往往存在很大差异。
存在很大差异。
现象现象33:
肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性,肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性,而基因的而基因的DNADNA序列并不发生变化。
序列并不发生变化。
现象现象44:
橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳,叶徒相似,橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳,叶徒相似,其实味不同。
同一种水果,在不同产地生长,其味其实味不同。
同一种水果,在不同产地生长,其味道,大小,外观可能相差很远。
道,大小,外观可能相差很远。
Basketballplayer?
Singer?
President?
TVhost?
如果他们出生在不同如果他们出生在不同的地方的地方基因环境表型表观遗传学相同的基因型相同的基因型不同的表型不同的表型?
什么是表观遗传学?
什么是表观遗传学?
表观遗传学:
表观遗传学:
基因序列无变化基因序列无变化基因功能发生变化基因功能发生变化可遗传并且是可逆的可遗传并且是可逆的表观遗传学机制:
表观遗传学机制:
DNADNA甲基化甲基化组蛋白修饰组蛋白修饰RNARNA调控(调控(RNARNA干扰,干扰,microRNAmicroRNA,longnon-coding,longnon-codingRNARNA等等)表观遗传学表观遗传学/Epigenetics基因型不变的情况下,影响表型并能遗传的基因型不变的情况下,影响表型并能遗传的现象,称为表观遗传或后生遗传。
现象,称为表观遗传或后生遗传。
表观遗传学研究的是在基因组表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的序列不变的情况下,在表型上具有的稳定的、可遗传情况下,在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜或潜在的可遗传性在的可遗传性)的变化。
的变化。
定义定义定义定义EpiEpigeneticsgenetics-Onoroverthegeneticinformationencodedinthe-OnoroverthegeneticinformationencodedintheDNADNA在细胞基因组上存在两类信息:
在细胞基因组上存在两类信息:
A-遗传学信息遗传学信息B-表观遗传学信息表观遗传学信息前者前者维持细胞活性功能工厂的所有物质材料维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者后者怎么建、何怎么建、何时建、在哪建的附加信息建、在哪建的附加信息基因组不仅仅是序列包含遗传信息,而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息,而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息,而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息,而且其修饰也可以记载遗传信息。
记载遗传信息。
记载遗传信息。
记载遗传信息。
DNAsequencecodingEpigeneticprogramming表观遗传的特点:
表观遗传的特点:
广泛,多样,广泛,多样,复杂复杂DNA甲基化甲基化染色质重塑染色质重塑RNARNA调控(调控(RNARNA干扰,干扰,非编码非编码RNA:
microRNARNA:
microRNA,longnon-codingRNAlongnon-codingRNA等等)表观遗传学目前的主要研究发现表观遗传学目前的主要研究发现二、二、DNA甲基化甲基化DNA甲基化甲基化组蛋白翻译后修饰组蛋白翻译后修饰RNA机制机制DNA甲基化的概念及机理1950年,年,Wyatt在在Nature上首次指出测序结果表明上首次指出测序结果表明DNA可能存在第可能存在第5碱基。
碱基。
DNA甲基转移酶:
DNMT胞嘧啶:
Cytosine5-甲基胞嘧啶:
5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸:
SAMS-腺苷-高半胱氨酸:
SAH高等生物基因组甲基化特点高等生物基因组甲基化特点1)广泛性广泛性2)可遗传性可遗传性3)可逆性可逆性4)组织特异性组织特异性CpG岛岛(CpGislands)在结构基因在结构基因5端附近的调控区段,端附近的调控区段,CG二联核二联核苷常常以成簇串联的形式排列,含量大于苷常常以成簇串联的形式排列,含量大于50%。
预测软件预测软件http:
/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.htmlhttp:
/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/广泛性广泛性可遗传性DNA的甲基化如何调节基因表达?
A:
A:
未甲基化或低度甲未甲基化或低度甲基化的启动子能够允基化的启动子能够允许转录正常进行。
许转录正常进行。
B:
B:
甲基化的甲基化的CpGsCpGs阻阻止转录因子的结合,止转录因子的结合,因此阻止转录。
因此阻止转录。
C:
MBP(Me-C:
MBP(Me-CpGCpGbindingprotein)bindingprotein)也也阻止转录因子和启动阻止转录因子和启动子区的结合。
子区的结合。
其他,如改变染色质结构,其他,如改变染色质结构,启动子高甲基化使基因表达受抑制DNA修复修复基因表达的调节基因表达的调节癌基因代谢癌基因代谢凋亡凋亡分化分化细胞周期细胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能三、三、DNA甲基化检测手段甲基化检测手段DNA甲基化检测方法总览主要检测途径主要检测途径3-1基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法3-2不基于重亚硫酸盐转化的方法不基于重亚硫酸盐转化的方法3-1基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析质谱分析水解核苷酸质谱分析基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2应用一应用一:
直接测序法(Directsequencing)直接测序法图图6PMVK基因扩增产物反向测序结果基因扩增产物反向测序结果图图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果基因扩增产物正向测序结果应用二:
应用二:
重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR,BSP)注:
A:
癌组织;B:
癌旁组织;:
未甲基化;:
甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果BSP克隆测序甲基化率三维图形应用三:
应用三:
甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR,MS-PCR)甲基化特异性甲基化特异性PCRPCRUMUMUMladder100150200250MSP法检测抑癌基因法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化启动子区的甲基化图图MSP检测组织切片检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化状态电泳图片甲基化特异性甲基化特异性PCR(MSP)结果,)结果,U为非甲基化,为非甲基化,M为甲基化。
为甲基化。
基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果注:
注:
M表示表示甲基化,甲基化,U表示未甲基化表示未甲基化B1-B6B1-B6为高脂血症高脂血症组六例六例标本,本,D1-D5D1-D5为正常正常对照照组五例五例标本;本;HH22OO为阴性阴性对照;照;mm为50bpMarker50bpMarker。
SREBP-1SREBP-1基因启动子区基因启动子区CpGCpG岛甲基化状态岛甲基化状态基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室甲基化特异性PCR优点:
优点:
操作简便;敏感性高。
缺点缺点:
引物设计要求高;只能作定性研究;存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性;只能了解部分位点的甲基化状态。
应用四:
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法基于限制性内切酶的工具酶基于限制性内切酶的工具酶甲基化甲基化特异性特异性的限制性内切酶:
的限制性内切酶:
可以识别甲基化的胞嘧啶可以识别甲基化的胞嘧啶甲基化甲基化敏感性敏感性的限制性内切酶:
的限制性内切酶:
可以识别甲基化的胞嘧啶可以识别甲基化的胞嘧啶基于限制性内切酶的甲基化分析方法基于限制性内切酶的甲基化分析方法基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室MSRE-PCR原理原理图图1-1MSRE-PCR1-1MSRE-PCR原理图原理图注:
左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,DNA保持完整,可以获得PCR产物.基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室本课题组应用举例二:
本课题组应用举例二:
采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法(MSRE-PCR)筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。
基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室图1-3:
DNM基因琼脂糖凝胶电泳图M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注:
M:
Marker;E:
加酶体系;A:
癌组织;B:
癌旁组织;空:
水空白基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优点点:
方法相对简单;可进行甲基化水平的定量研究;需要样本量少。
缺点缺点:
只能获得特殊酶切位点甲基化情况。
优点优点:
可同时检测基因组内多个CpG位点。
实验结果易解释,成本低廉。
缺点缺点:
由于CG仅限于内切酶识别序列中,因此非识别序列的CG将被忽略;只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意;需要样本量大;存在酶消化不完全引起的假阳性的问题;不适用于混合样本。
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法应用五:
甲基化敏感性单链构象分析(methylationspecificsingle-strandconformationanalysis,MS-SSCA)甲基化敏感性单链构象分析甲基化敏感性单链构象分析甲基化敏感性单链构象分析优点点:
能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析;能够对甲基化的等位基因进行半定量;可以提示甲基化状态分布的不均匀性。
缺点缺点:
只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开,而较低水平的则不易分开,有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象,故敏感性及准确性略低;检测片段不宜过长。
应用六:
基于亲和纯化的甲基应用六:
基于亲和纯化的甲基化分析方法化分析方法基于亲和纯化的甲基化分析方法基于亲和纯化的甲基化分析方法应用七:
应用七:
ChIP-Seq技术技术ChIP-Seq应用八:
芯片技术在甲基化应用八:
芯片技术在甲基化检测中的应用检测中的应用启启动子区甲基化芯片技子区甲基化芯片技术基因芯片杂交信号图基因芯片杂交信号图应用九:
HRM高分辨熔解曲线分析高分辨熔解曲线分析HRMHRM技术:
用于筛选大量样本,获得感兴趣的CpGCpG位点鉴定感兴趣的CpGCpG岛。
HRM技术原理技术原理HRMHRM技术原理技术原理HRM特点高灵敏性:
可检测低达0.1%甲基化程度。
高通量:
1次可同时检测不超过384样本,适用于大样本多位点甲基化扫描。
高重复性:
重复性100%。
使用范围广:
不受碱基位点局限。
操作简便:
只需设计特异引物,无须序列特异性探针,无需测序。
标本范围广:
可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本,也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。
应用十:
焦磷酸测序法是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应每一轮测序反应体系中只加入一种dNT
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- DNA 甲基化 及其 检测