浅论EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响Word文档格式.docx

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BARF1genehadallaroundoncogenicabilityingastricepithelialcellsandmayplayanimportantroleinthewholeprocessofoccurringandpromotingEBVassociatedgastriccarcinoma.

［Keywords］EpsteinBarrvirus;

BARF1;

gastriccancer;

cellbiologicalbehaviorEB病毒属于人γ疱疹病毒，与多种恶性肿瘤相关，如Burkitt淋巴瘤、Hodokin病、鼻咽癌以及胃癌等。

约2%～16%的胃腺癌组织中可检测到EB病毒潜伏感染所表达的EB病毒编码的小RNA，称为EB病毒相关胃癌［1］。

BARF1是EB病毒编码的癌基因，约90％病毒相关胃癌组织中可检测到BARF1蛋白［2,3］，但其在病毒相关胃癌发生中的作用尚不十分清楚。

我们采用BARF1真核表达载体转染的方法，建立BARF1稳定表达的胃癌细胞系，全面探讨BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响，从而初步了解其在EB病毒相关胃癌细胞中的致癌作用。

1材料和方法

　细胞株、引物、质粒及实验材料　

EB病毒转化的绒猴淋巴细胞系B958和人胃癌细胞系SGC7901为中国科学院上海细胞库提供。

所用引物根据文献［4，5］合成，见表1，其中引物1为克隆用，引物2为鉴定用。

引物合成及DNA序列测定委托上海生工生物工程公司进行。

改良pSG5真核表达载体［用PshBI从pcDNA3载体上切下新霉素抗性表达单元，插入到pSG5的NdeI位点］为日本北海道大学遗传医学研究所肿瘤病毒室高田贤藏教授惠赠。

pGEMTEasyTA克隆载体购于Promega公司，质粒和真核细胞DNA提取和琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒购于Axygen公司。

限制性DNA内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶及DNA去磷酸化试剂盒购于TaKaRa生物工程公司。

细胞转染试剂Lipofectamine2000购于Invitrogen公司，RPMI1640和DMEM培养基、G418和真核细胞RNA提取试剂Trizol购于Gibco公司。

新生牛血清购于民海生物工程公司。

RTPCR试剂盒购于Toyobo公司。

细胞培养板、细胞迁移实验用Transwell小室购于Corning公司。

表1引物序列

　BARF1稳定表达细胞克隆的获得与鉴定

　细胞培养B958使用RPMI1640，SGC7901使用DMEM，均添加10％NCS，100U/ml青霉素和100g/ml链霉素，培养于37℃，5％CO2环境中，2～3d换液1次。

　pSG5/BARF1真核表达载体的构建提取B958细胞DNA作为模板，用PCR扩增BARF1的ORF［4］。

产物长度为697bp，经琼脂糖凝胶电泳回收，然后连接到pGEMTEasy载体，转化大肠埃希菌DH5α并进行蓝白筛选，挑选白色菌落扩增后提取质粒，EcoRⅠ酶切后，电泳回收715bp片段。

pSG5载体同样酶切并去磷酸化后，与该片段连接，转化DH5，挑取菌落扩增提取质粒，酶切鉴定插入方向，并进行DNA序列测定。

　细胞转染与克隆pSG5/BARF1及pSG5对照质粒用Lipofectamine2000转染细胞，操作按说明书进行。

用有限稀释法进行克隆，转染后第3天将细胞消化分散，按每孔100个细胞接种96孔细胞培养板。

整个过程用含300g/mlG418的培养液进行筛选培养，每周换液一次，直至长出抗性克隆，然后扩大培养。

　BARF1表达鉴定采用RTPCR进行。

用Trizol法提取细胞总RNA并进行逆转录，操作按说明书进行。

然后用PCR扩增BARF1ORF内部一段序列［5］，产物用％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像仪中摄影。

选取3个表达量相对较高的克隆进行细胞生物学行为的观察，并随机抽取3个pSG5转染细胞克隆作为对照。

　细胞生物学行为的观察

　细胞凋亡诱导实验处于对数生长期的细胞消化分散后，配成×

106/ml细胞悬液，按每孔150μl接种于96孔板，24h后加入终浓度为15μg/ml的顺铂继续培养。

每24h将细胞消化分散，经台盼蓝染色后进行计数。

然后以时间为横轴，细胞存活率为纵轴，绘制细胞存活曲线。

DDP作用96h后，去掉DDP，PBS洗2次，换加10％NCS新鲜培养液继续培养，每日观察细胞形态的变化。

DDP诱导24,48h细胞用Hoechst33342进行染色，显微镜下观察细胞凋亡情况。

正常细胞核被染成均匀荧光，细胞核局部呈强荧光染色者则判断为处于凋亡期的细胞。

共随机计数500个细胞，最后以凋亡细胞数除以细胞总数即为细胞凋亡率。

每细胞克隆计数3个复孔。

　细胞增殖实验处于对数生长期的细胞消化分散后，配成×

105/ml细胞悬液，按每孔200μl接种于96孔细胞培养板中进行培养。

每24h将细胞消化分散，台盼蓝染色后进行计数。

每细胞克隆计数3个复孔，取均值。

然后以时间为横轴，活细胞数量为纵轴，绘制细胞增殖曲线。

　软琼脂集落形成实验按文献［6］方法进行。

24孔细胞培养板每孔接种细胞4×

103个，每天观察集落形成情况，以16个以上细胞判断为一个集落，培养至第15天计数集落数并测量集落大小。

在100倍显微镜下每孔随机计数5个视野，每细胞克隆做3个复孔。

　细胞迁移实验按Corning公司说明书进行。

对数生长期细胞以无血清DMEM洗涤两次后，在含％NCS的培养基中培养过夜，使细胞处于血清饥饿状态。

次日消化收集细胞，以％NCS的培养基配制成5×

106/ml的细胞悬液，取ml加于Transwell小室上层，下层加入ml含10％NCS的培养基，置37℃，CO2条件下培养。

每细胞克隆做3个复孔，分别于6，12和24h后取出，擦去上层细胞，10％甲醛固定30min，结晶紫染色30min后，于100倍显微镜下观察，随机取5个视野计数下层细胞。

　统计学方法　

两组间均数比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。

2结果

　pSG5/BARF1表达载体的鉴定

pSG5/BARF1全长kb，EcoRⅠ酶切后应水解为kb和kb两个片段，结果与预期相吻合。

DNA测序结果100％符合。

　转染细胞BARF1表达的鉴定

pSG5/BARF1转染细胞克隆的BARF1mRNA检测为阳性，而载体转染对照为阴性。

　细胞诱导凋亡的存活曲线

培养液中加入15g/mlDDP后即迅速诱导细胞的凋亡，但BARF1表达细胞的存活率下降速度较对照组慢，48h时差异已较为显着，至96h时pSG5对照组存活细胞数已下降至原来的％，而BARF1组尚有％。

　Hoechst33342染色

Hoechst33342染色后可见两组细胞均有凋亡情况发生，但BARF1组比空载体组凋亡率低，24h后即有明显差异，48h后差异更为显着。

　细胞增殖实验

从细胞增殖曲线可以看出，BARF1表达的细胞增殖速度明显快于对照组，至第4天差异有统计学意义，第5天起有极显着意义。

培养第5天对照组活细胞数已达最高，随后开始下降。

而BARF1表达细胞至第6天细胞总数仍在继续增加。

按第3和第5天之间计算2组细胞的倍增时间分别为h和h。

a：

15g/mlDDP诱导48h后Hoechst33342染色结果；

b：

Hoechst33342染色后的凋亡率统计；

与pSG5比较，*：

;

**：

　软琼脂集落形成实验

培养8d后，可见到BARF1表达细胞开始有集落出现。

12d后，BARF1组可见到较多的集落形成，细胞呈堆积性生长，一般大小约有～μm，生长状态良好。

而空载体组只看到零星的细胞，偶尔也能看到极少数的集落，但是其直径不足μm，而且细胞已经开始死亡。

15d后，BARF1组集落继续增大，培养基pH值降低，而对照组多数细胞已开始进入死亡期。

20d后，培养基pH值已低于，BARF1组仍有部分细胞存活，而对照组细胞已全部死亡。

（a）BARF1表达细胞（b）pSG5对照细胞图6软琼脂中形成的典型集落表2软琼脂集落形成实验结果

　细胞迁移实验结果

BARF1组细胞迁移速度比对照组快，随着培养时间的延长，差异越来越明显，至24h，与对照组比较差异有统计学意义。

表3细胞迁移实验结果

　　3讨论

BARF1基因位于EB病毒基因组BamHIA40kb长的片段内，属于EB病毒的早期基因。

最近的研究表明，它在EB病毒潜伏感染状态亦可表达［2,7］。

BARF1能够诱导原代猴肾上皮细胞的永生化［4,8］，抑制紫杉醇诱导的人胃癌细胞的凋亡［5］，增强NPC细胞的肿瘤原性［9］、诱导小鼠成纤维细胞［10］和EB病毒阴性的人B细胞系［11-13］的恶性转化，其编码的蛋白具有很强的促有丝分裂原活性［12,14］。

这些研究表明，BARF1属于EB病毒致癌基因，且在不同种类细胞中的作用可能有所差异。

本文在胃癌细胞系SGC7901上的研究发现，BARF1的表达能够抑制抗肿瘤药物DDP诱导的细胞凋亡，增强细胞在恶劣条件下的存活能力。

去除DDP并换加新鲜培养液继续培养4天后，BARF1表达细胞形态已基本恢复到诱导前的良好状态并开始增殖，而对照组仍然维持诱导时的形态。

推测，当凋亡诱导因子被去除后，BARF1能帮助细胞迅速摆脱凋亡途径，重新回到正常细胞周期。

BARF1的抗凋亡作用在原代猴肾上皮细胞［4］、胃癌细胞BGC823［5］、鼠成纤维细胞［6］中也被观察到，而EB病毒相关胃癌组织中也观察到细胞凋亡指数的下降［15］，这可能是BARF1表达的结果。

一些EB病毒相关肿瘤中，对某些抗肿瘤药物的抗性可能也与BARF1表达有关［16-19］。

研究表明，BARF1基因的抗凋亡作用可能是通过调节细胞凋亡相关基因的表达从而抑制细胞凋亡通路而实现的。

例如，BARF1转染的鼠成纤维细胞Bcl2基因表达上调［6］，BARF1表达的胃癌细胞BGC823中Bcl2/Bax比率增加，一些凋亡通路分子如半胱氨酸蛋白酶等的表达量也发生变化［5］。

本文结果还显示，除了抗凋亡作用外，BARF1有直接促胃上皮细胞增殖的作用。

细胞增殖曲线显示BARF1表达细胞的增殖速度明显快于对照组，细胞倍增时间比pSG5对照减少倍。

在培养后期，随着营养消耗及代谢产物堆积，培养环境逐渐变得不利于细胞生长与存活。

故对照组5天后活细胞数开始下降，而BARF1组至第6天细胞总数仍在继续增加。

说明对照组细胞对培养环境中的不利因素更为敏感，而BARF1能够增强细胞抵抗环境中的凋亡诱导因素，促进细胞增殖，故可推迟死亡发生的时间，维持更长时间增殖。

这与Wei等［4］在原代猴肾上皮细胞上的研究结果相似，说明BARF1能够直接促进上皮细胞的增殖。

其机理可能与BARF1能够活化细胞周期、上调细胞增殖相关基因的表达和刺激细胞生长因子分泌有关［5,12］。

Wang等［5］在胃癌细胞系BGC823上只观察到BARF1的抗凋亡作用，而没有促增殖作用，这与我们的结果不同，推测其原因可能源于细胞间的差异。

大量研究表明，BARF1的功能表现与细胞种类有关［4,11,13］。

虽然同为胃癌细胞系，BGC823为低分化恶性胃癌细胞，其生长速度可能已接近极限，故可能对BARF1表达引起的促细胞增殖相关因子不够敏感，因而增殖速度变化不明显。

而本文所用SGC7901为中分化胃癌细胞系，恶性度相对较低，故能更好地显示BARF1基因的生长促进作用。

软琼脂集落形成实验结果表明，BARF1表达细胞在软琼脂上形成的集落数显着多于pSG5转染细胞，且平均体积较对照组大，在陈旧培养基中的存活能力较强，说明BARF1增强了SGC7901细胞的肿瘤原性。

BARF1在淋巴瘤细胞中也有这种能力［11］，而在原代猴肾上皮细胞中虽可抵抗凋亡和促进其增殖，但在裸鼠体内却不能诱发肿瘤［4］，说明BARF1的致癌能力与细胞种类有关。

细胞迁移实验结果表明，BARF1表达细胞的血清趋化迁移能力较pSG5转染细胞增强，说明BARF1增强了SGC7901的侵袭转移能力。

一般认为，肿瘤的发生与发展是一个漫长而连续的过程，可以分为促发、演进、侵袭与转移三个阶段。

促发阶段的主要特征是细胞凋亡的抑制，演进阶段细胞增殖速度进一步加快，而侵袭与转移阶段为肿瘤演化的晚期行为。

本文结果表明，BARF1表达能够抑制DDP诱导的SGC7901细胞凋亡，使细胞增殖速度显着加快，提高软琼脂中的集落形成率和细胞迁移能力。

说明BARF1基因能够全面增强胃上皮细胞的肿瘤原性，提示其可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中均起重要作用。

Wang等［5］通过基因芯片分析表明，BARF1表达使胃癌细胞一些与细胞增殖、凋亡、周期、黏附等相关基因的表达量有明显上调，也说明了BARF1基因对细胞状态的影响是全面的。

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