分子实验自我总结Word格式文档下载.docx

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5-20℃保存

61%胶，恒压150V,电泳10-20分钟

2.简述DNA片段的重组（连接反应）原理和操作步骤

将插入片段与载体片段按>

3:

1的比例添加

载体2µ

l（100ng）

目的片段（0.7kb）?

µ

l（100ng）6µ

l

10XT4ligasebuffer1µ

l

T4连接酶1µ

ddH2O补齐到总体积10µ

反应总体积10µ

混合于EP管（标记）中且混匀,Short离心

Ø

16C保温14小时,若不马上转化,-20C保存

3.简述大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞制备及重组质粒的转化

大肠杆菌DH5a感受态的制备过程

1.接单菌落振荡培养过夜

2.1%（50ul）菌液接种到含5mlLB的试管中，37℃振荡培养1-2小时至OD0.4-0.5，转移到离心管

3.离心5000rpm，4℃，3min,去上清

4.1ml0.1MCaCl2处理，悬浮细胞

5.冰上静置20min

6.5000rpm，4℃离心5min，去上清

7.100ulcacl2悬浮，冰浴待用

以上相同

1.100µ

l的感受态细胞分成2管（50µ

l/EP管）

2.按照表格加各种DNA样品

3.冰浴20min（10min）

4.（热击）42℃，90sec，静置，勿摇动

5.迅速放到冰上,冰浴2min

6.（复苏）加入950µ

lLB液体培养基（无抗性，无菌），标明组号，37℃，200rpm（150）摇床培养30min

4.菌落PCR鉴定的原理及过程

1、DNA模板的制备（挑取细菌沉淀）

2、引物设计与合成（教师已做）

3、PCR扩增GFP基因

1.PCR变性，退火，延伸温度

（95℃预变性5min）

1.94℃（90-96）变性45sec双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.50℃（60-65）退火45sec系统温度下降，部分引物与模板的单链DNA的特定序列相配对结合

3.72℃（70-75）延伸45sec在Taq酶的作用下，以目的基因为模版，从引物的3’端始合成与模板互补的DNA链

（72℃（70-75）延伸5min）

4、琼脂糖电泳检测

5.简述金属离子螯合亲和层析法分离纯化蛋白质的操作步骤

一、收集菌体（已完成）

1.取10mLIPTG诱导3小时的细菌培养液至一支15mL离心管中，平衡，5000g离心5min，弃上清。

2.用1.2mlLysisBuffer将菌体重悬，转移至一个1.5mLEP管中，12000rpm离心1min，弃上清。

将菌体沉淀置－20℃冰箱保存。

二、裂解细胞

1.将上次保存的菌体取出，室温解冻后加入700uLLysisBuffer7uLPMSF（100mM）、70uL溶菌酶（100mg/mL）、7uLRNaseA（1mg/mL）、3.5uLDNaseⅠ（1mg/mL），轻轻混匀后30℃孵育15min，其间每隔半分钟轻轻摇动一次混合液。

2.15000g离心10min，将裂解上清转移至另一离心管中。

三、蛋白纯化

1.向裂解上清中加入Ni-IDAResin悬液100uL（吸取前充分混匀），轻柔混匀，冰上放置30min，其间每1min轻轻颠倒一次。

2.将裂解上清与Ni-IDAResin的混合液转移至一个离心吸附柱，3000g“short”离心1min，弃流穿液。

3.重复步骤2，直到所有样品都加到吸附柱中。

4.向柱中加入600uLWashBuffer，3000g“short”离心1min，弃流穿液。

5.重复步骤4两次。

6.将吸附柱放在一个干净的1.5mLEP管上，向柱中的Resin加入50uLElutionBuffer，静置2min。

3000g“short”离心1min。

7.将流穿液重新吸回至吸附柱，重复洗脱2次。

可在紫外灯下观察洗脱效果。

8.将吸附柱及Resin交回给老师，洗脱下来的蛋白做好标记保存在－20℃。

6.简述质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测操作

1、挑选阳性克隆子培养（已做）

2、抽提质粒

11.5-5ml过夜培养菌液,倒入EP管中（标记）,10000rpm离心1min,弃上清。

2加入250µ

l溶液I（含RNaseA），充分混匀。

3加入250µ

l溶液II，轻轻混匀，室温放置2min。

4加入350µ

l溶液III，轻轻混匀，13000g离心10min。

5将上清液转移至纯化柱中（标记），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。

6在纯化柱中加700µ

lDNA漂洗液（含70%乙醇），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。

7重复步骤6。

8再次13000g离心2min,用于干燥纯化柱。

9丢掉下层收集管，将纯化柱放入新的1.5mlEP管（标记）。

10小心加入30ul50-60度预热的ElutionBuffer（Tbufferor纯H2O）（要加到柱子正中间，是液体均匀扩散到DNA吸附填料上），室温放置2min，13000g离心1min，下层新EP管中液体为所纯化的质粒DNA。

3、酶切分析，10ul体系

4、电泳鉴定，1%胶，110V

7.蛋白质诱导表达的原理及过程

1.原核表达载体转化到BL21（DE3）菌株中。

2.挑取单菌落于2mLKan+LB培养基培养过夜。

（已做）

3.以20%的比例转接于20mLKanrLB培养基中，培养约40min至OD600=0.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。

（课前已做）

4.取1mL菌液,制样作为未诱导对照。

5.三角瓶中加入IPTG40uL（0.5M）至终浓度为1mM，30℃诱导外源蛋白表达。

待纯化样品的收集和制备：

●收集14ml诱导好的菌液（150min）于15ml离心管中，。

●倒掉上清液，用1.2mllysisbuffer（裂解缓冲液）重悬菌体，

●6000g离心1min，去上清，菌体沉淀冻存到-20℃。

8.目的DNA片段回收的原理及过程（玻璃纤维柱法）

一．电泳分离目的片段

二．目的片段凝胶的回收（切胶）长波紫外灯下切取，控制在100-200ul电子天平称量

三．纯化估计体积0.1g=0.1ml加入3倍体积的溶胶液水浴溶胶10min，每2-3min涡旋震荡

四．装柱溶胶液加入吸附柱EC中12000rpm离心1min

五．漂洗加入加入700µ

lWB漂洗液（事先加入指定量的无水乙醇）12000rpm离心30s弃滤液

六．洗脱加入30ulEB洗脱液放置20min离心1min

9.蛋白纯化的原理及过程

2.用1mLLysisBuffer将菌体重悬，转移至一个1.5mLEP管中，12000rpm离心1min，弃上清。

1.将上次保存的菌体取出，室温解冻后加入613uLLysisBuffer，7uLPMSF（100mM），重悬。

2.向重悬液中加入70uL溶菌酶（10mg/mL）、7uLRNaseA（1mg/mL）、3.5uLDNaseⅠ（1mg/mL），轻轻混匀后30℃孵育15min，其间每隔半分钟轻轻摇动一次混合液。

3.15000g离心10min，将裂解上清转移至另一离心管中。

1.向裂解上清中加入Ni-IDAResin悬液100uL（注意：

吸取前充分混匀），轻柔混匀，冰上放置30min，其间每1min轻轻颠倒一次。

2.将裂解上清与Ni-IDAResin的混合液转移至一个废旧的DNA吸附柱中。

3.500g“short”离心10s，弃流穿液。

4.向柱中加入600uLWashBuffer，500g“short”离心10s，弃流穿液。

5.重复第“4”步两次。

500g“short”离心10s。

10.简述诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳检测操作步骤

1、配胶

30%丙烯酰胺溶液——单体

0.5mol/LTris（pH6.8）浓缩胶1.5mol/LTris（pH8.8）分离胶——缓冲液

10%SDS——变性剂

TEMED四甲基乙二胺——催化剂

10%过硫酸铵——交联剂

2、灌胶——分离胶下，浓缩胶上，分离胶在梳子下沿1cm，加400ul水密封，注意气泡

3、点样及电泳——Tris-甘氨酸电泳缓冲液，80V进胶，120V电泳

4、染色和脱色——考马斯亮蓝染色过夜，脱色液脱色1-2h

5、观察

实验一：

质粒DNA的提取及鉴定

1.分子生物学实验常用载体有哪些?

它们的特点是什么?

常用载体：

大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒、酵母人工染色体载体、动植物病毒载体。

特点：

具有（与受体细胞相适应的）复制子（一段具特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制）、可检测的遗传表型（标记基因）、限制性内切酶单一识别位点（便于外源基因插入）、适合的拷贝数（有利于载体制备；

使细胞中克隆基因的剂量增加）

1.质粒提取的常用方法

碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）

苯酚抽提法（酸性、低离子强度时，超螺旋在水相分布）

CsCl法密度梯度离心（EB插入造成DNA浮力密度不同，大量提取质粒DNA）

SDS裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）

玻璃纤维膜法（试剂盒）

2.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些异同点？

相同：

提取的步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解。

不同：

质粒提取过程中，有一个DNA变性、复性的过程，这个与基因组提取完全不同，这是利用质粒是以超螺旋结构存在于大肠杆菌中的特殊状态，分离纯化质粒时总是会利用这个特点来分离基因组DNA与质粒DNA。

（从细胞中提取到的染色体DNA大多断裂成线状分子，质粒DNA为超螺旋共价闭合环状结构，在PH很高时，基因组DNA易解旋变性，而质粒DNA的两条互补链不会完全分离，再将PH调至中性时，质粒DNA又恢复其天然构象。

3.核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？

1）酚、氯仿作用是变性蛋白质。

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:

1）使用。

2）异戊醇是消泡剂。

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为24：

1之比。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：

24:

1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：

1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

4.在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？

加入EDTA螯合Mg2+,Ca2+等金属离子，从而抑制DNase的活性，防止DNA被降解（酶的活性中心通常会有金属离子，才能使蛋白质单体结合成蛋白质复合体）

5.纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染，对它的后期操作有何影响？

DNA制品中的蛋白质、酚污染会降低内切酶的活性，影响酶切效果。

6.有哪些因素影响核酸的沉淀？

1.核酸的浓度2.溶液中的盐离子与杂质的含量3.用于沉淀的醇的种类和比例

7.提质粒时，溶液2为什么现配现用？

溶液2中的主要成分是NaOH和SDS。

NaOH是裂解细胞膜的主要成分，长时间与空气接触会吸收二氧化碳，导致碱性下降，不利于破碎细胞，影响质粒的产量。

8.加入溶液3后产生的白色沉淀成分是什么？

钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS。

SDS专门和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。

9.为什么用TE缓冲液悬浮和保存质粒更好？

TE是Tris-HCl和EDTA的简称。

在后续对质粒的操作中,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,其他缓冲液系统（如磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等）虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀。

而Tris-HCL（pKa=8.0）缓冲系统使用缓冲对是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

不存在金属离子，不产生干扰作用

10.碱裂解法的原理和步骤（步骤见ppt）

原理：

根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。

当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。

11.酚抽提的酚的两个作用

使蛋白质变性沉降、抑制DNase活性

12.漂洗过程中，空转EC柱的作用是什么？

使漂洗液完全被转下来

实验二、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测

1. 

对核酸进行限制性酶切时应注意什么？

保证样品纯度（DNA制品中的污染蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等会影响内切酶活性）

对于酶切条件的控制（合适的酶反应体积、酶作用单位、反应时间）

2.如何提高核酸电泳的分辨率？

1提高琼脂糖凝胶的密度

2.降低跑电泳的电压

3.增大跑电泳的时间等.

4.改用聚丙烯酰胺凝胶 

3．影响限制性内切酶的因素：

DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、盐离子等等）

解决办法：

增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂

增加酶作用单位（过多的甘油抑制酶活性）

延长反应时间（1-16小时）

4.凝胶电泳的原理

DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样。

凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

5.影响泳动速率的因素

电场强度

DNA在电泳条件下带负电荷，在电场作用下向正极泳动

分子量大小与DNA构型

质粒三种构型的泳动速率：

超螺旋、线型、开环

凝胶浓度

电泳缓冲液：

TAETBE（大于实际分子量）TPE

实验三、DNA片段的回收及连接反应

单酶切重组DNA有哪些弊端，如何避免？

弊端:

1.末端相同，可能发生自连，产生大量无效连接产物；

2.插入片段没有方向性，由于末端相同，因此插入片段顺反均可连接

避免方法：

1.使用双酶切，电泳分离切下片段与剩余片段

2.若用单酶切，可以将载体5’末端去磷酸化（用碱性磷酸酶处理），质粒片断无法自连

3.并提高插入片段与载体的浓度比，提高插入片断与载体粘性末端的结合概率。

2. 

在不计算DNA片段浓度的情况下，如何快速简便的估算连接片段的比例？

用DNA片段条带与DNAmarker中已知量的条带的亮度比例，用目测来估量，将电泳后两者的灰度值之比认作质量比

3.DNA连接反应的原理步骤、两种常用的筛选方法（见ppt）

DNA重组：

在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接,获得重组DNA分子。

一．DNA片断的回收

电泳分析定量，分别计算出PEG-28a酶切质粒载体片断与EGFP酶切目的片段的溶胶液的浓度

二．DNA片断的重组

将插入片段与载体片段按照大于3：

1的比例添加：

载体片段，目的片段，10×

T4ligasebufferT4连接酶（Mg2+、ATP存在）ddH2O

4. 

质粒重组的影响因素？

1．反应温度；

2.连接酶的用量；

3.DNA末端的性质；

4.DNA浓度及两种DNA分子数的比例

5. 

连接时目的基因和载体的最佳摩尔比

最佳比例是由构造及末端的类型决定的，一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例，如2：

1甚至5：

1。

6.DNA回收照胶紫外线使用短波还是长波？

应使用长波紫外灯。

因为短波紫外线（254nm）会引起DNA链断裂，或是造成基因突变。

7.漂洗液中为什么要含有75%的乙醇

因为用含有75%乙醇漂洗时，DNA会沉淀下来，而含有的一定的水则与上一步提取时的裂解液中的高盐互溶，从而又能高效地除去盐离子等杂质。

而如果用无水乙醇，则虽然能将DNA-阳离子沉淀下来，但DNA中混入的较多盐离子却难以除去。

8. 

乙醇中为什么不加盐？

参考答案：

洗的时候不加盐是为了除盐，做乙醇沉淀时加盐是因为单价阳离子有利于聚沉DNA

9．DNA连接酶两个主要特点是什么；

•1.催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键；

（切口（nick）：

DNA分子糖-磷酸主键的破坏。

缺口（gap）：

DNA分子中核苷酸缺失。

）

2.DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接（这个算不算？

）。

10．连接反应体系的加样顺序是什么

ddH2O,10×

T4缓冲液,DNA片段,最后加T4DNA连接酶

？

片段缓冲液连接酶水

11.在设计酶切和连接的时候，应该特别注意什么？

阅读框的保证

12.如何提高DNA片段的回收率

1.保证胶充分溶解，如适当延长水浴时间，并增加上下颠倒的次数

2.减短紫外灯下切胶的时间，防止DNA部分降解

3.制胶要均匀，保证跑出的条带更加集中清晰，同时切胶时应尽量切除不包含目的片段的胶块

4.尽量使用新鲜配置的电泳缓冲液

5.适当延长离心时间，确保胶溶液完全通过玻璃纤维柱，同时可以多洗脱几次，确保洗脱完全

回收率低的原因

1.胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加胶溶液的比例

2.胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能溶解就预先将其切成小块，分多次回收

3.紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量将时间控制在30S

4.洗涤液使用后未及时盖紧瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率

5.TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸收能力，应及时更换电泳缓冲液，最好食用新鲜配置的电泳缓冲液

6.回收前的样品量太少

7.洗脱前，延长65℃预热时间，延长室温静置时间，增加洗脱次数

13.回收实验中两个最重要的技术指标

产物的纯度：

未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应

产物的回收率：

否则增大前期工作量

14.回收方法

（1）纤维素膜电泳回收洗脱较为困难，不适合作较大的DNA片段

（2）透析袋电洗脱法操作麻烦并易造成DNA酶的污染

（3）冻融法

（4）玻璃粉法

（5）低融点琼脂糖凝胶法（羟乙基）操作方便简单，需要特殊的凝胶，成本高

（6）玻璃纤维柱法快速高效，方便完全

15.玻璃纤维柱法的原理及特点

利用特殊硅基质材料，在一定高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。

快速高效，方便安全

用途：

回收，浓缩，去除杂质，更换缓冲系统，探针制备等。

16．目的片段回收（玻璃纤维柱法）的步骤

二