制药工程专业基础实验药物分析部分Word格式文档下载.docx
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可分为吸附,分配,离子交换,凝胶渗透四种高效液相法、本实验采用ODS柱进行反相高效液相色谱。
通过本实验应掌握内标法,外标法定量的原理,方法及优缺点并加强高效液相色谱仪的操作技能训练。
内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差,精密称取样品后,加入一定量的内标物,然后制成适当溶液进样分析。
根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积比,求出某组分的含量。
外标法又称校正法或定量进样法。
本法要求能准确地定量进样,配制一系列已知浓度的标准液,在同一操作条件下,按同量注入色谱仪,测量其峰面积(或峰高),作峰面积(或峰高)与浓度的标准曲线.然后在相同条件下,注入同量样品溶液,测量待测组分的峰面积(或峰高),根据标准曲线,计算样品中待测组分的浓度。
氯霉素是抗生素类药物,微溶于水,且具苯环结构,所以可以用反相高效液相色谱法进行分离,并用UV254nm进行检测,甲醇-水作流动相。
三、实验主要仪器设备和材料
试剂及仪器
高效液相色谱仪,柱ODS柱(15cm×
5mm),电子天平,100ml容量瓶,氯霉素标准品,2mg/ml对硝基苯酚(内标)标准贮备液,氯霉素眼药水样品,甲醇等。
氯霉素:
广谱抗生素,原在土壤中。
1947年从南美洲委内瑞拉的委内瑞拉链霉菌中提取,1949年实现人工合成
四、实验方法、步骤及结果测试
(一)实验条件
高效液相色谱仪
柱ODS柱(15cm×
5mm)
流动相:
内标法甲醇:
水(60:
40);
外标法甲醇:
水(80:
20)
流速:
0.7ml/min
波长:
254nm
采样时间设置:
5min
进样量:
10ul
(二)标准贮备液的制备(待修改)
1mg/ml氯霉素标准贮备液的配制:
精密称取氯霉素100mg至100ml容量瓶中,以甲醇溶解,并稀释至刻度。
2mg/ml对硝基苯酚(内标)标准贮备液的配制:
精密称取对硝基苯酚约200mg置100ml量瓶中,以甲醇溶解,并稀释至刻度。
(三)内标法测定氯霉素的含量
1、相对校正因子的测定
分别精密吸取对硝基苯酚标准贮备液各2.5ml,置5个10ml容量瓶中,再分别精密加入氯霉素标准贮备液1,2,3,4,5ml?
,用甲醇稀释至刻度,摇匀.色谱仪基线平稳后。
分别进样0.5ul得色谱图。
测量对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高,按公式计算相对校正因子:
fi内标=(Wi/Ai)/(W内标/A内标)
或fi内标=(Wi/hi)/(W内标/h内标)
式中:
Wi--氯霉素重量;
W内标--对硝基酚的重量;
Ai(hi)--氯霉素的峰面积(峰高);
A内标(h内标)--对硝基苯酚的峰面积(峰高)。
本实验中,由于峰形较窄,可采用峰高法。
2、样品含量测定
精密吸取眼药水适量(约相当于氯霉素5.0mg,标示量为2.5mg/ml),置10ml容量瓶中,并加入对硝基苯酚的贮备液2.5ml,用甲醇稀释至刻度,摇匀,进样0.5ul,得色谱图。
按下式计算标示量的百分含量。
标示量%=(Wi/W)×
100%=(hi/h内标)•(W内标/W样)•fi内标×
100%
(四)外标法测定氯霉素的含量
1、标准曲线的制备
分别吸取氯霉素标准贮备液各1,2,3,4,5ml置10ml容量瓶中。
甲醇稀释至刻度,各进样10ul,以峰高对浓度作图,得标准曲线。
2、样品测定
精密吸取眼药水适量(约相当于氯霉素2.5mg)置10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,进样10ul,得色谱图,根据峰高从标准曲线上查得相应的浓度,并计算标示量的百分含量。
五、思考题
1.怎样选择流动相?
水在流动相中有什么作用?
2.如何保证进样的准确性?
3.内标物应该具备什么条件?
4.内标法和外标法各有什么特点?
六、实验安排
每班分5组,每组确定一个组长
第一组:
老师讲解,标准样品进样,5个标样,1个待测样,负责绘制保准曲线,采用标准曲线法进行定性定量分析。
其他组:
依次实验,由上一组组长讲解,进2个样:
待测样+标样中的任何一个。
采用外标一点法进行定性定量分析
盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸检查
一、实验目的
1.掌握TLC法测定有关物质的原理与测定方法。
2.熟悉粘合薄层板的制备与活化。
二、实验内容和要求
(一).薄层色谱法(本实验不做铺板实验,直接用买来的硅胶G板)
(1)玻板用5cm×
20cm或l0cm×
20cm的规格,要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。
(2)固定相常用固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。
其颗粒大小.一般要求直径为10-40µ
m,取各品种项下规定的固定项一定量,按“薄层板制备”法制备薄层板。
(3)薄层涂布一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;
前者系固定相直接涂布于玻板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂,一般常用10%-15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140oC加热4h),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5%-0.7%)适量调成糊状,均匀涂布于玻板上。
(4)展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,底部应平整光滑,便于观察。
薄层板制备根据各品种项下规定,取1份固定相和3份水(或粘合剂)在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后,用倾注法或平铺法或涂布器法,在玻板上涂布厚度为0.2-0.3mm的薄层板。
将涂好薄层的玻板置水平台上,于室温下晾干后在110oC烘30min;
置有干燥剂的干燥箱中备用。
使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视).
点样用微量注射器或微量吸管吸取规定量样品溶液,点样于薄层板上,—般为圆点,点样基线距底边2.0cm,样点直径为2-4mm,点间距离约为1.5-2.0cm,点样时必须注意勿损伤薄层表面。
展开展开缸如需预先用展开剂饱和,可在缸个加入足够量的展开剂,并在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,一端浸入展开剂中,密封缸顶的盖,使系统平衡.将点好样品的薄层板放人展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底0.5-1.0cm(切勿将样点浸入展开刑中),密封缸盖,待展开至规定距离(一般为10-15cm),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测。
三、实验主要仪器设备和材料
层析缸,玻板,喷雾器,点样用微量注射器或微量吸管。
硅胶H,硅胶GF254,对二甲氨基苯甲醛,盐酸普鲁卡因注射液.
四、实验方法、步骤及结果测试
精密量取本品,加乙醇制成每1mL中含盐酸普鲁卡因5mg>
的溶液(浓度高,显色明显)(显色快),作为供试品溶液。
另取对氨基苯甲酸对照品,加乙醇制成每1mL中含60ug>
(浓度高,显色明显)(显色慢)的溶液,作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录A)试验,吸取上述两种溶液各10uL,分别点于含有羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上)(在保证不弄破薄层板的基础上,重复点三次,便于显色)用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇(14:
1:
l:
4)为展开剂,展开后,取出晾干,用对二甲氨基苯甲醛溶液(2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100mL,加冰醋酸5mL制成)喷雾显色(盐酸普鲁卡因显色快,对氨基苯甲酸显色慢)。
供试品溶液如显与对照品溶液相应的杂质斑点,其颜色与对照品溶液的主斑点比较,不得更深。
五、实验报告要求
记录实验详细步骤及分析结果。
六、思考题
1.TLC分析定性定量方面的应用?
七、实验说明及注意事项
1.薄层色谱分析中为使斑点集中,点样应分次点加,每次点加后,候其自然干燥、低温烘干或经温热气流吠干。
2.荡层板故入层析缸时,薄板底边应水平浸入展开剂中,待展开至溶剂前沿距玻板顶端2-3cm时,取出薄层板。
3.展开缸必须密封,为使缸内展开剂饱和,薄层板故人前可在层析缸内壁贴滤纸条,让滤纸条一端浸入展开剂中,密封层析缸,待系统平衡后再将薄层板故入,展开。
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