亚硝酸根对厌氧氨氧化过程的抑制作用Word文档下载推荐.docx

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最高转换率的标准评价由评估滞后次数和底物/产物转换率共同决定。

2、材料和方法

2.1.测压试验设备

实验在配备着测压传感器的密闭瓶中进行，该测压传感器包括360数据点数据存储系统。

该系统以前就用于评价厌氧氨氧化的活性。

测压装置由340毫升小瓶组成，这些小瓶提供了压力传感器测量头（灵敏度级别在1百帕）。

每一个小瓶有两个侧孔由可刺穿的橡胶隔膜封闭着，这两个侧孔分别用于底物注射和抽样。

2.2.生物质能的起源

生物质能的最先使用源于Dokhaven-Sluisjesdijk污水处理厂中全规模厌氧氨氧化反应器。

这个反应器包含了厌氧氨氧化颗粒污泥和在SHARO反应器中部分亚硝化反应处理后的水。

颗粒尺寸分布主要借助于图像分析的方法，得出94%勺颗粒直径都在1.1士0.2mn范围内。

实验期间，厌氧氨氧化反应器在7.1kgN/

m3.d的设计容积负荷下运行。

2010年期间反应器的平均运行条件为：

温度在34士2.5°

C,PH直在7.2士0.4，污水中氮的含量分别为氨氮50士20mg/L,亚硝氮为15士15mg/L,硝态氮为95士20mg/L。

由荧光原位杂交技术（FISH）测定出生物质由“Brocadia”浓缩形成，污泥与AMX82探针杂交，而不是与KST15探针杂交。

2.3.测压试验的一般程序

颗粒污泥样本在无充气条件下运送至实验室（运送时间为30分钟），直接用于实验测试。

生物质存在于被冲刷并重新悬浮的洗涤介质中：

该介质包含微量元素用来避免养分的限制，并且该微量元素存在于25毫摩HEPE的缓冲液中。

介质的PH!

应用0.1摩尔/升的氢氧化钠或者硫酸调节到7.5。

在此之后，液体上部空间（200mL）应喷入氮气以便维持缺氧条件。

瓶子被放置在恒温摇床上，在170rpm和30°

C条件下，使顶压温度保持稳定（可升高温度使其产生变化）。

当超压时自动泄压（通过插入一根针连接到一个装满水的容器作为水锁）并且注入底物基板。

注入的溶液是由亚硝酸钠，硫酸铵和碳酸氢铵溶于超纯水中形成，并且该溶液要高温高压灭菌。

在没有附加说明时，初始的铵根和亚硝酸根浓度应该为50mgN/L为了避免无机碳限制反应进程同时考虑到在反应达到平衡时部分无机碳会挥发到顶空，最初的碳酸盐浓度应为32.7mg/Lo顶空氮气的生产和积累造成的压力增加，使得在整个测试过程中测量和后续处理记录自动进行。

一旦压力达到一个恒定值（假定所有亚硝酸盐都要转换），液体样品进行化学分析

（PH1。

氨氮，亚硝酸盐和硝酸）。

2.4.初步测试

在测量最大厌氧氨氧化活性（MSA）A的初步分析时，为了保证该方法的准确性和可靠性，数据都要根据par.2.3一式两份。

不同批次的生物量在整个实验期内进行相同测试运行，排除任何影响生物量组成的变化在全规模反应器中。

■氨和亚硝酸盐水平：

铵盐的起始浓度为40,50,60,70和80mgN/L，亚硝酸根的起始浓度待测。

最初的生物量浓度为1.0gVSS/L。

这个测试也可以用来评估氮的平衡。

■生物量水平：

在铵盐为40mgN/L,亚硝酸盐40mgN/L的测试中

应用不同的生物量标准（0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0g

VSS/L）;

在铵盐为60mgN/L，亚硝酸盐60mgN/L的测试中也

应用上述的生物量标准。

■缓冲溶液的影响：

生物量悬浮在5.3毫摩每升的磷酸盐缓冲液以及HEPE（25毫摩每升）的缓冲区或非缓冲介质中（培养基组成的其余部分按上述标准配制）。

实验数据一式三份。

2.5.亚硝酸盐暴露试验后的厌氧氨氧化活性

当暴露（潜在）抑制化合物测试之前，试验过程在par.2.3在中描述，具体步骤是使单一组分硝酸盐（亚硝酸钠）或多组分的铵盐（硫酸铵和亚硝酸盐）暴露1或24小时，随后进行洗涤（Fig.1,步骤A）。

对氨和亚硝酸盐的毒性进行测试，在接触介质中测试氨氮和亚硝酸盐的摩尔氮浓度。

硝酸钠添加到曝光控制监测介质中（未曝光生物量），硝酸钠浓度为70mg/L以避免硫酸盐发生还原反应。

在这些测试中所使用的步骤方法如图1所示（步骤A）,包括以下几个阶段：

i）缺氧条件下暴露在不同浓度毒物中1,2或24小时

ii）取样时测定PH直，然后测定氨氮，亚硝酸盐和硝酸盐含量

iii）在清洗介质中清洗悬浮生物质

iv）通过喷射获得缺氧条件，调节压力容器和恒温摇床（170rpm和

30C）

v）等待约60分钟，用一根针插入浸在水中的氯丁橡胶管内，以便维持压力稳定

vi）注射一定剂量的铵盐，亚硝酸盐和无机碳浓缩液（步骤见前面相关段落）

vii）第二底物浓度（只有明确表示执行程序：

见前面段落）

viii）化学分析取样

2.6.亚硝酸盐抑制试验

测试亚硝酸盐在厌氧氨氧化活性的抑制作用按照步骤B进行（改

编于步骤A,见图1）。

在洗涤介质中存在的生物量（见前面段落），在洗涤介质中还含有铵盐浓度为85mgN/L（例如碳酸氢氨）。

压力平衡后，压力逐渐降低，注入0.5-4毫升硝酸钠溶液以实现所需的起始浓度（见表1），测压试验开始。

测压试验控制包括铵盐50mgN/L和亚硝酸盐50mgN/L。

2.7.暴露后的长期效应亚硝酸盐暴露后，评估连续注射无毒的氨和亚硝酸盐水平的影

响，试验执行了步骤A的拓展步骤（步骤C）,暴露在亚硝酸盐1000mgN/L中24小时。

控制实验是由两个标准测压试验组成，没有毒性测试。

该方法要重复进行4次。

此外，测压测量发生在曝光阶段（24小时长

期测压测试；

所谓曝光相面值见par3.4）。

悬浮介质中也含有碳酸氢铵0.1gN/L。

把浓缩的亚硝酸盐溶液（在Milli-Q中溶解亚硝酸钠溶液）注入压力容器中，保证初始亚硝酸盐浓度为1gN/L。

洗涤后，

生物量悬浮于悬浮介质中，脱气，用以去除氧气并且连续注射五个梯度的浓度（称为1-5批次在par3.4;

初始的铵盐和亚硝酸盐浓度高达50mgN/L）。

在2小时的毒形暴露之后，进行洗涤后的首次测压试验。

在进行毒性暴露24小时后，随后分别在8,23,27,94小时进行测压试

2.8．亚硝酸盐抑制试验条件抑制相关的测试，要么测试暴光后亚硝酸盐的快速影响（如亚

硝酸钠），要么测试曝光后的铵盐的影响（如硫酸铵）和设计时间如上文描述。

概述测试条件如表1所示。

2.9.计算

2.9.1该方法的准确度

该方法计算总氮量平衡的相对误差时，同时考虑液相和气相（参考网上其他材料）。

2.9.2最大厌氧氨氧化活性和活性百分比从记录的压力随时间增加的数据中，最大的氮气产率计算（参考网上其他材料）。

区分所观察到的在瓶子中的生物量值，计算最大特定厌氧氨氧化活性并用氮气中氮的含量表示（单位为g/（gVSS）.d。

图2显示了一个典型的测压试验，该图中所显示的数据是从初步测试数据报告得出的。

曝光后活性百分比维持在一个恒定的值，计算抑制化合物方面检测量的平均值（未曝光生物量）。

2.9.3底物/产物的摩尔比和滞后期底物的摩尔比（铵根转换为亚硝酸根）和产物（硝酸根转换为铵根）通过计算实验前后液体样本中含氮化合物的浓度（参考网上其他资料）。

为了量化底物注入和产生的最大的特定厌氧氨氧化活性延迟的一个参数叫做滞后期（见图2所表示的图形计算结果；

参考网上其他资料）。

2.10.分析程序

通过分光光度流动注射分析测定可溶性氮化合物

（QuickChem850系列2FIA系统，Lachat仪器，拉夫兰，科罗拉多州，

美国；

参考网上其他资料。

根据标准方法测定TS餉VSS

图1,通过实验程序：

步骤A:

暴露后测试活动；

步骤B:

亚硝酸盐抑制试验；

步骤C:

长期暴露后的长期活动*只有当明确表示才可以进行第二次测压试验。

3.结果

3.1.该方法的准确度

一个初步检测就是多次重复测量用以评估特定厌氧氨氧化活性

的方法的准确性和可靠性（MSAA。

测试初始铵盐和亚硝酸盐浓度是

40-80mgN/L（总氮浓度是80-160mgN/L），这个数值的选择低于文

献中所指出的，但是足以让全部的生物量在底物（亚硝酸盐）耗尽前被激活。

铵盐浓度是50mgN/L和亚硝酸盐浓度是50mgN/L（总氮浓度是100mgN/L），这个浓度被选为标准测压试验的初始浓度。

通过十次重复试验证明出MSA数值变化小于2%MSA值显示出生物量浓度的独立（0.2-4gVSS/L）并且只显示出很小的变化值（5%。

进一步测试的适宜生物量浓度为2gVSS/L。

在没有PH值缓冲液时，整个测试中PH值将会从7.5增加到7.9。

HEPE和磷酸盐缓冲液使整个实验过程中PH值维持恒定（一般PH值为7.5，除了特别要求）。

在随后的实验中，HEPE缓冲液（25毫摩）被选定为缓冲溶液。

没有迹象显示，这些缓冲液对厌氧氨氧化活性产生负面影响。

测量精度由氮质量平衡来评估检查。

氮平衡的误差不到5%就表明

压力测量是准确的。

观察到R_NiArrtr匕率为1.35（士0.07）及R_NaAm比率为0.28（±

0.06），测试表明厌氧氨氧化细菌在测试过程中生长正常。

重复使用相同的生物进行测试。

试验中表明匕率由第一、第二次的1.4-4%增长到了第三、第四次的2-8%。

第二、第三和第四次试验得出了和第一次试验几乎相同的结果，并没有表明促进或者抑制影响作用。

3.2亚硝酸盐对厌氧氨氧化转换的抑制作用

MSA的实验过程是按照步骤B在不同的亚硝酸根浓度下进行的

（铵盐的浓度为85mgN/L）实验用以评估转换过程中的亚硝酸盐的抑制作用。

MSA由初始浓度（亚硝酸盐浓度为50和500mgN/L）逐渐下降（如图3所示）。

现有的亚硝酸根的残余活性在1000mgN/L和3000mgN/L时分别为7呀口3%经过测定亚硝酸盐的半最大抑制浓度（IC50）为400mgN/L。

随着初始亚硝酸盐浓度增加到500mgN/L时，滞后期也在加长，达到最大值为70分钟。

初始亚硝酸盐浓度直到500mgN/L时R_NiAr和R_NaA的值（如图4）才更接近标准化学计量比率。

在较高的亚硝酸盐的浓度值下R_NiAr和R_NaA的的比率有所增加，例如在亚

硝酸盐浓度为3000mgN/L时R_NiAn和R_NaA的的比率分别为2.97和0.75。

3.3曝光测试

曝光实验根据步骤A进行，由活性测试组成，该活性测试是经有潜在毒性的亚硝酸盐或铵盐和亚硝酸盐溶液预处理后在标准（无毒）条件下进行。

在潜伏期分别为1,2,或24h后，要在清洗介质中删除（可能）含氮化合物例如亚硝酸盐、氨、亚硝酸盐和生物量。

此后进行了活性测试。

050Tin^[nvn]100150

Lagphase

oM=l二p.vmppz:

-"

N

图2:

典型的测压试验一氮气产量（mmo）,该氮气产量是通过理想气体定律从记录数据计算出（hPa）。

所显示数据来源于初步测试。

点划线表示计算出的滞后期数值。

♦

02004006008001000

Initialnitriteconccniraiion[mgN/IJ

图3:

最大特定厌氧氨氧化转换率（MSAA作为一个非暴露生物量转换百分比）

3.3.1氨和亚硝酸盐的暴露

氨和亚硝酸盐的浓度为250-2000mgN/L（总氮浓度为500-4000mg

N/L），在曝光阶段氨氮和亚硝酸盐部分降解。

把铵盐和亚硝酸盐的初始浓度为250mgN/L的溶液，进行24小时曝气，亚硝酸盐能够全部去除。

暴露于高浓度中，暴露时间不足以转换全部的亚硝酸盐（低于40%。

暴光一小时，可以使在250mgN/L低浓度下的铵盐和亚硝酸盐转换15%

图5（1A）显示，在1和24小时暴露后，厌氧氨氧化活性百分比和测试底物浓度之间的关系。

暴露于较高浓度下导致了较低的活性值。

当铵盐和亚硝酸盐的浓度高达500mgN/L时，在暴露时，厌氧氨氧化

活性并没有显著变化。

暴露在浓度为2gN/L1小时后，MSA减少了32%暴露于浓度为1和2gN/L铵盐和亚硝酸盐24小时后，MSA减少了50%

图5（2A）显示，曝光后氨和亚硝酸盐的滞后期长度在4到12分钟

内，在整个曝光时间内浓度增加到500mgN/L。

对于较高的暴露浓度，暴露24小时后，暴露时间和浓度显著上升到77分钟和2gN/L。

暴露一小时后，滞后时间就从没超过24分钟。

图5（3A）所示，R_NiAr和R_NaA在暴露于较高的铵盐和亚硝酸盐浓度时，仍然持续增长。

图5（4A）所示，虽然硝酸生产水平稳定，当生物量暴露在较高的氨氮和亚硝酸盐含量时氨氮去除率有所下降。

0»

0250500

Initialnitriteconcentration[mgN/L]

图4:

测压活性测试中，在不同的初始亚硝酸盐浓度下所对应的R_NiAm

和R_NaA值；

连续虚线代表厌氧氨氧化细菌R_NiAr和R_NaA的理论

值。

AmjwnmmMdnitrile[mgN/L]知nnwrwrnundmlnle[mgN/L]Nitnlc[mgN/L]

eipasureunderexposureundereiposureunder

AnKmhiccondili⑷害Aerobicc^nditinn^Anaerobicco<

idiitinns

图5:

列A显示的是，在缺氧条件下不同浓度的铵盐和亚硝酸盐经过暴露厌氧氨氧化活性测定如图所示，暴露1小时（封闭符号），暴露2

小时（开放符号）表示。

列B是铵盐和亚硝酸盐在好氧条件下所测数据。

列C是亚硝酸盐在缺氧条件下测得数据。

X轴所示浓度为暴露期间亚硝酸盐的浓度（mgN/L）。

第一行表示最大特定厌氧氨氧化转换率

（MSAA作为一个非暴露生物量转换百分比）。

第二行表示暴露后滞后期长度（分钟）。

第三行表示R_NiAm（・，口）和R_NaAnO・，3的转换率；

连续的虚线代表R_NiAr和R_NaA的标准值。

第四行表示暴露后在标准测压批量测试中的铵去除率。

3.3.1.氨和亚硝酸盐暴露于有氧环境为了判断氧气是否对氨和亚硝酸盐的暴露有额外效果，在有氧条件下暴露后进行活性测试（在缺氧条件下）。

初期实验是测定暴露在含铵盐50mgN/L,亚硝酸盐50mgN/L,氧气8mgN/L溶液中24小时后的生物量，这个实验显示出没有活性缺失，在标准的缺氧条件活性测试中滞留期小于30分钟（具体数据没有指出）。

在曝光阶段，暴露在氧气中完全抑制铵盐和亚硝酸盐转换，初始值和最终数值的差值小于等于实验误差。

经过1小时的曝光后，标准缺氧活性的测试结果MSAA减少不到10%见图5（1B）。

暴露在含1gN/L铵盐和亚硝酸盐（24%含2gN/L铵盐和亚硝酸盐（32%中，使MSA含量大量减少。

随着曝光时间的增加，滞后期也在增加，但是始终小于在缺氧条件下暴露在氨和亚硝酸盐含量为2gN/L的溶液中24小时后测得的最大延迟时间33分钟见图5（2B）。

也是暴露于氧气中，硝酸盐的产率就为9.9mgN/L

（是由50mgN/L亚硝酸盐转化），但是铵盐的转化率比预期的要低

（暴露在2gN/L的溶液中1小时铵盐的后剩余83%暴露在2gN/L的溶液中24小时铵盐的后剩余60%），造成了与化学计量标准不符的现象见图5（3B和4B）。

在第二次试验中得出，曝光（1小时或者24小时）后铵盐转换率显著增加（至少达到预期转换率的88%），逐渐接近生化反应的理论预测值。

3.3.2仅暴露亚硝酸盐

在图5（1C）中，所示图形表示暴露亚硝酸盐（缺少铵盐）1小

时或者24小时后的活性。

在曝光期间亚硝酸盐并没有显著地转换。

在亚硝酸盐浓度为1gN/L中硝酸根产率小于4mgN/L,这类似与生物量的控制（结果没有显示）。

暴露在6gN/L溶液中1小时后，亚硝酸盐的负面影响限制了最大活性，使最大活性值降低了22%。

暴露24小时后MSA大量减少。

暴露在2gN/L溶液中24小时的效果和暴露在1gN/L中长生的效果是一样的。

暴露在6gN/L溶液中，活性降低了60%和先前的试验相比，第二次注射亚硝酸盐和铵盐曝光后活性增加了6-23%见图6。

随着暴露浓度增加到2gN/L，暴露浓度和暴露时间也逐渐增加。

由于亚硝酸盐暴露，滞后期没有增加，除了在亚硝酸盐浓度特别高时，滞后期才会增加。

第二次污泥测试中，再次表现出正常的滞后时间，表明了生物量的复苏，见图5（2C）。

暴露在亚硝酸盐浓度为5-11mgN/L和37-43mgN/L时，分别测定硝酸盐的产率和铵盐的消耗率，得出R_NaA比率分别为0.14和

0.31，见图5（3C）。

在增加曝光浓度，并没有观察到案的去除率有所减少，见图5（4C）。

3.3.2.1PH值对仅暴露亚硝酸盐的影响

在暴露亚硝酸盐2小时后，在PH值对亚硝酸盐转化影响实验中分别进行了PH直为6.8和7.8的实验。

在以上所述的试验条件中，MSAA

分别减少了18呀口19%（见图7）,和图5（1C）中PH为7.5时相比。

在

PH直分别为6.8和7.8是暴露2小时后，MSA并没有明显的变化。

在没有铵盐的暴露中没有亚硝酸盐被去除。

往往认为亚硝酸盐为导致毒性的化合物。

在不同PH直的活性测试中，没有注明亚硝酸盐对厌氧氨氧化细菌有抑制作用。

增加了10倍亚硝酸浓度，PH直为6.8和PH值为7.8相比总亚硝酸盐浓度不影响抑制实验观察。

因此总亚硝酸盐含量确定抑制程度。

30

20

10匡<

vss

0IVII

0200040006000

Exposurenitrite|mgN/L]

图6:

第一个测压试验后进行第二测压试验，在不同浓度的亚硝酸盐分别暴露1小时和24小时。

60

40

0LI_I_,__U_I_j__LI_I_|

05001000

Exposureconcentrationofnitrite[mgN/L]

图7:

分别暴露在亚硝酸盐溶液中2小时的，最大特定厌氧氨氧化活性（非暴露生物量转换百分比）；

在PH为6.8时（浅灰色条形表示），

在PH为7.8时（深灰色条形表示）。

误差条表示标准偏差。

34亚硝酸盐暴露后的厌氧氨氧化活性的长期复苏

使厌氧氨氧化生物量暴露于亚硝酸盐浓度为1000mgN/L24小时

后，计算估计出亚硝酸盐的可逆性。

在培养期间要继续跟踪厌氧氨氧化的活性。

生物量被冲洗干净，在铵盐和亚硝酸盐浓度为50mgN/L

的溶液中进行98小时内连续进行五个测压试验（一个批次五个实验）。

在亚硝酸盐浓度为1000mgN/L的溶液培养时，会是活性逐渐丧失。

两小时后进行监控检测活性失去93-94%o去除活性污泥中亚硝酸盐的活性后滞后期长度增长到20分钟，而在同一污泥的连续试验的滞后期均不到8分钟。

在洗涤去除生物量后进行第一次连续三次测试期间，测得最大特定活性在增加，在第三次，第四次和第五次试验中测

得数据存在微小的差异（图8和表2所示）。

在这些测试中硝酸盐和铵盐的比例保持在正常的范围内

--二L匸匚二UA四L三Z

0100200300400

Time|min]

图&

在整个测压测试中氮气产生的时间。

标签标明相应的测压试验的缩写。

在24小时的曝光阶段测试中仅显示了前350分钟的试验情况

Table2-24-Hourlongexposureto1gNL^1nitrite>

followedbyfivesuccessivemanometrictestsconductedafterbiomasswashingandrelativetoanunexposedcontrolassay:

maximumspecificanammoxactivity（MSAA）anddurationofeachtest

Manometrictest

Manometrictestduration[hj

MSAA[gN2-N

（gVSS）-1d-1]

Controla